本方法规定了辣椒制品中苏丹红I的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用辣椒酱、辣椒油、辣椒粉中苏丹红I的快速测定。
2 原理
本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的苏丹红I与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化，通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中苏丹红I进行定性判定。
3 试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1 试剂
3.1.1 乙腈。
3.1.2 无水硫酸镁。
3.1.3 正己烷。
3.1.4 二氯甲烷。
3.1.5 氢氧化钠。
3.1.6 氢氧化钠溶液（2mol/L）：称取氢氧化钠（3.1.5）8g，用水溶解并稀释至100mL。
3.1.7 无水乙醇。
3.1.8 复溶液：将无水乙醇（3.1.7）与水按照体积比25:75混匀。
3.2 参考物质
苏丹红I参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥95%。
表1 苏丹红I参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量
注：或等同可溯源物质。
3.3 标准溶液的配制
3.3.1 苏丹红I标准储备液（1mg/mL）：精密称取苏丹红I参考物质（3.2）适量，置于10mL容量瓶中，加入适量乙腈（3.1.1）超声溶解后，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1mg/mL的苏丹红Ⅰ标准储备液。-20 ℃避光保存，有效期6个月。
3.3.2 苏丹红I标准中间液（1μg/mL）：精密量取苏丹红I标准储备液（1mg/mL）（3.3.1）100μL，置于100mL容量瓶中，用乙腈（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1μg/mL的苏丹红I标准中间液。
3.4 材料
3.4.1 固相萃取柱：CNW Poly-sery MIP-SDR固相萃取柱（200mg/3mL），或相当者。
3.4.2 苏丹红I胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为辣椒酱、辣椒油、辣椒粉。
3.4.2.1 金标微孔。
3.4.2.2 试纸条或检测卡。
4 仪器和设备
4.1 移液器：200μL、1mL和5mL。
4.2 涡旋混合器。
4.3 离心机：转速≥4000r/min。
4.4 电子天平：感量为0.01g。
4.5 氮吹仪。
4.6 水浴锅。
4.7 环境条件：温度15℃～35℃，湿度≤80%。
5 分析步骤
5.1 试样制备
取适量样品，液体样品或半固体样品充分混匀，固体样品充分粉碎混匀。
5.2 试样的提取
5.2.1 辣椒酱
称取辣椒酱2g（精确至0.01g）于15mL离心管中，加入0.5g无水硫酸镁（3.1.2）和5mL正己烷（3.1.3）提取液，涡旋振荡1min后，4000r/min离心5min。将上清液全部加入到固相萃取柱（3.4.1）中，流出液弃去。再加入6mL正己烷淋洗固相萃取柱，流出液弃去。用2mL二氯甲烷（3.1.4）洗脱固相萃取柱，收集洗脱液吹干。精密加入400μL复溶液（3.1.8），涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。
5.2.2 辣椒油
称取辣椒油5g（精确至0.01g）于15mL离心管中，加入8mL正己烷（3.1.3）进行提取，涡旋振荡1min后，将上清液全部加入到固相萃取柱中，流出液弃去。再加入6mL正己烷淋洗固相萃取柱，流出液弃去。用2mL二氯甲烷（3.1.4）洗脱固相萃取柱，收集洗脱液吹干。精密加入400μL复溶液（3.1.8），涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。
5.2.3 辣椒粉
称取辣椒粉3g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入8mL乙腈（3.1.1）提取，涡旋振荡1min后，6000r/min离心5min。转移上清液于10mL离心管中，吹干后加入2mL氢氧化钠溶液（3.1.6），涡旋混匀30s后置于80℃水浴皂化5min。再加入2mL正己烷（3.1.3），涡旋萃取30s后，6000r/min离心5min，转移上清液于新的10mL离心管中，加入无水硫酸镁（3.1.2）0.5g，涡旋振荡30s后，4000r/min离心5min，转移上清液于10mL离心管中吹干。精密加入400μL复溶液（3.1.8），涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。
5.3 测定步骤
5.3.1 试纸条与金标微孔测定步骤
吸取200μL待测液于金标微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3～5min，将试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育5～8min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。
5.3.2检测卡与金标微孔测定步骤
吸取200μL待测液于金标微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3～5min，将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，温育5～8min，进行结果判定。
5.4 质控试验
每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。
5.4.1 空白试验
称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
5.4.2 加标质控试验
准确称取空白试样（精确至0.01g）置于具塞离心管中，加入一定体积的苏丹红I标准中间液（3.3.2），使苏丹红I添加浓度为10μg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
6 结果判定
通过对比控制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视判定示意图见图1。
6.1 无效
控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。
6.2 阴性
检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中苏丹红I低于方法检测限，判定为阴性。
6.3 阳性
检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中苏丹红I的含量高于方法检测限，判定为阳性。
6.4 质控试验要求
空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。
a） 试纸条
b） 检测卡
图1 目视判定示意图
7 结论
当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。
8 性能指标
8.1 检测限：辣椒酱、辣椒油、辣椒粉的检测限为10μg/kg。
8.2 灵敏度：灵敏度应≥99%
8.3 特异性：特异性应≥85%。
8.4 假阴性率：假阴性率应≤1%。
8.5 假阳性率：假阳性率应≤15%。
注：性能指标计算方法见附录A。
9 其他
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。
本方法参比标准为GB/T 19681-2005《食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法》。
