目前，各种果蔬汁和果酒不断涌现，果蔬发酵汁已由单一原料、单一发酵剂发展至现在的多种原料、多种复合发酵剂，多菌协同发酵能够赋予果蔬汁更优的风味和口感。但所选菌种数较少，范围较窄，多为单菌发酵或双菌发酵，且在国内外，在乳酸菌发酵过程中对有机酸进行具体分析方面的报道很少。
来自西北农林科技大学食品科学与工程学院李维妮、张宇翔和魏建平等人以红富士苹果为主要原料，利用副干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌协同发酵苹果汁，研究不同菌种比例、接种量和发酵时间对苹果汁活菌数和感官评分的影响，在单因素试验的基础上进行响应面优化试验，并对苹果汁中的有机酸进行动态监测。旨在研制出一种富含能够调节人体肠道功能的乳酸菌苹果汁，不仅拓宽了对乳酸菌的选择，还优化了发酵工艺条件并分析出有机酸的具体变化，为乳酸菌在发酵果蔬汁方面的应用提供理论依据。
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苹果汁发酵条件的单因素试验
1.1
发酵温度对苹果汁活菌数及感官评分的影响
当发酵温度较低时，乳酸菌生长和繁殖速度较慢，活菌数随着温度的升高而显着增加（P＜0.05）。当温度高于37 ℃时，苹果汁的活菌数变化不明显（P＞0.05）。在35～39 ℃时，感官评分差异不显着（P＞0.05），而温度过高对苹果汁的风味和口感也会有所影响。当发酵温度为37 ℃时，苹果汁的活菌数为23.6×107 CFU/mL，感官评分为82 分。综合考虑选择37 ℃为最佳温度。
1.2
菌种比例对苹果汁活菌数及感官评分的影响
当副干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌比例为1∶2∶2∶1时苹果汁的活菌数最多，为29.9×107 CFU/mL，显着高于其他组（P＜0.05）。当菌种比例为1∶1∶1∶1时感官评分最高，为80 分。为进一步检验不同菌种比例对苹果汁活菌数和感官评分的影响是否显着，对试验结果进行单因素方差分析，结果P值均小于0.01，不同菌种比例下的活菌数和感官评分差异极显着。因此在该单因素试验中，综合考虑后选择副干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌比例为1∶2∶2∶1为最佳比例，并确定1∶2∶2∶1、2∶1∶2∶1、1∶1∶1∶1、2∶2∶1∶1和1∶2∶1∶2的菌种比例作为下一步工艺优化的5 个水平。
1.3
接种量对苹果汁活菌数及感官评分的影响
当接种量在1%～3%时，活菌数随接种量的增加呈明显上升的趋势（P＜0.05）。当接种量为3%时，苹果汁的活菌数为最高，达21.0×107 CFU/mL，显着高于其他组（P＜0.05）。当接种量大于3%时，活菌数呈逐渐下降趋势。从整体来看，感官评分随着接种量的增大呈现出逐渐减少的趋势。采用方差分析法对苹果汁的活菌数和感官评分进行显着性分析，结果接种量对活菌数和感官评分均极显着（P＜0.01）。考虑节约成本、简便操作等因素，选择接种量为3%，并且选择1%、2%、3%、4%和5%的接种量作为下一步工艺优化的5 个水平。
1.4
发酵时间对苹果汁活菌数及感官评分的影响
发酵至21～26 h时，苹果汁活菌数升高较快，并且在发酵26 h时达到最大值30.0×107 CFU/mL，之后则呈下降趋势，相对应的感官评分也降低，可见发酵时间过长会对苹果汁的风味和口感有所影响。为进一步检验发酵时间对苹果汁活菌数和感官评分的影响是否显着，对试验结果进行单因素方差分析，结果表明发酵时间对两者有极显着影响（P＜0.01）。综合考虑，选择26 h为最佳发酵时间，并选择22、24、26、28 h和30 h的发酵时间作为下一步工艺优化的5 个水平。
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CCD响应面优化
2.1 优化结果和方差分析
在响应值为感官评分的模型中，A（菌种比例）、B（接种量）、C（发酵时间）及AB、AC、BC的交互作用及A2对苹果汁感官评分的影响极显着，B2和C2对其影响则不显着。
2.2. 因素间交互作用分析
在交互作用对苹果汁的活菌数和感官评分影响中，菌种比例、接种量和发酵时间两两因素交互项均产生了显着影响。
2.3 模型验证实验结果
通过该回归方程求得优化后的最佳工艺参数为副干酪乳杆菌∶动物双歧杆菌∶嗜热链球菌∶嗜酸乳杆菌菌种比例1∶1∶1∶1、接种量2%、发酵时间24 h，此条件下发酵得到的苹果汁活菌数预测值为21.44×107 CFU/mL，感官评分为78.35 分。在此条件下进行验证实验，结果显示，该条件下发酵得到的苹果汁的活菌数为19.85×107 CFU/mL，与预测值相比误差为7.4%，感官评分为80.23 分，与预测值相比误差为2.4%，可见通过响应面优化方法得到的苹果汁最佳工艺条件比较可靠。
2.4 最佳发酵条件下苹果汁有机酸的动态变化
苹果汁富含多种有机酸，还可在发酵中产生，这些有机酸的种类和含量对苹果汁发酵后的感官品质有着重要的影响。果汁中的有机酸不仅对果汁的感官特性、稳定性、可接受性和营养品质上有重要影响，还能避免或抑制许多引起果汁腐败的潜在有害微生物的生长。采用上述所得最佳工艺条件对苹果汁进行发酵，并用高效液相色谱法监测发酵过程中苹果汁各有机酸的变化趋势。在苹果汁发酵过程中，共监测了8 种常见有机酸的变化情况。
结 论
乳酸菌发酵苹果汁的优化工艺条件为菌种比例1∶1∶1∶1、接种量2%、发酵时间24 h、发酵温度37 ℃，在此条件下得到的活菌数为1.985×108 CFU/mL，感官评分为80.23 分。采用最佳工艺条件发酵苹果汁，利用高效液相色谱法对发酵过程中苹果汁有机酸的变化情况进行分析，结果表明：经过发酵后，苹果酸和琥珀酸含量下降明显（P＜0.05），而乳酸、奎宁酸、柠檬酸、酒石酸、丙酮酸和莽草酸含量均显着提高（P＜0.05）。
