还是老规矩，测定原理之类的标准上都有，测试之前仔细看清楚就行，这里就不再赘述了，下面就按照日常的测试流程给大家梳理一遍，里面会提及常见的问题及注意事项。
1、标准溶液的制备：标准品一定要准确称量，而且计算需要量的时候要考虑标准品含水量之类的因素，不要算错了，标准溶液是标杆，它如果出现错误，后面的每一步就都没有意义了，建议除了工作液现用现配外，储备液和中间液先都一起配好，贴好试剂标签，放4℃冰箱保存，还有要注意，配置标准溶液时不要称样，称样的时候不要配置标准溶液，以防交叉污染，重要的事情说三遍，这点每篇都在强调，所以大家要注意哦。
2、样品的制备以样液的提取：这部分也按照标准操作就好，根据样品的基质不同选择相应的前处理方法，如果样品是比较容易溶解的乳粉类，就可以直接称量到容量瓶里面进行定容，如果样品是含淀粉较多的面条或米粉类，先称取样品到洁净的150mL小烧杯里，加入30mL柠檬酸缓冲液，121℃灭菌15min，冷却到室温后加入1mLα-淀粉酶溶液和1mL木瓜蛋白酶溶液，然后就放到36℃培养箱里过夜培养，不要超过24h，然后95℃水解30min（这一步是降解前面加入的酶，去除酶对实验的影响）调pH，用水定容，然后进行后续提取操作，如果是生物素强化剂或营养品之类的样品，生物素含量很高，记得计算正确稀释倍数，多次稀释时也要注意减少误差，不然就要白做了哟，这里要注意区分样品的基质，油性的样品基本不适用微生物方法来测生物素的含量，我试过很多次，感觉无法从油水分离的东西里面提取生物素，如果大家有好的方法，欢迎推荐并讨论哦~
3、培养基的制备：同样的，生物素测定用培养基最好买进口的，推荐BD家的，然后就是煮沸的时候多让它沸腾几次，让培养基完全溶解，冷却到手能拿住烧杯的温度，过滤，过滤，过滤，重要的事情说三遍，一定要过滤煮沸过的培养基，去除杂质，不然有可能整条标线都会废掉，然后让过滤过的培养基在冰箱中过夜，第二天再用。
4、菌种的制备：植物乳杆菌的活性很好，不需要像标准中叙述的先划平板再接肉汤那么麻烦，直接肉汤培养就好，先做一管磁珠，-70℃冻干保存，用之前直接挑一个磁珠接入乳酸杆菌肉汤，36℃培养不要超过20小时，否则菌会长过，活性太强，影响结果准确性，这个有磁珠的肉汤管不要丢，可以在4℃冰箱中保存一个月，下一次接菌直接从含有磁珠的肉汤管里面分别吸取一滴分别加入两管新鲜的乳酸杆菌肉汤，这样一来是备用，二来是保证下次吸取的菌液活性较好，如果大家觉得一个月时间有点太久，可以使用半个月就重新接一个磁珠。
5、标准曲线的制作：这个就完全按照标准来做就好，注意灭菌温度是121℃，5min，时间过久会使培养基变色，影响实验结果，灭菌后要迅速冷却试管，可以放在冰水里面冷却，不然培养基颜色也会变深，影响实验结果。一般标准曲线和样品测试管我都会做两平行，保证结果准确性和重现性，我觉得双平行是在实验准确性和可行性之间一个比较好的平衡点。加水、培养基、标液和样液的时候推荐使用吸管法吸取，最好用洗耳球吸取，其次是用电动枪吸管法，当然这两种方法非常考验臂力，基本做完实验两条胳膊已经麻木了，但是这样操作误差比较小，最后的实验结果会比较准确，如果你实在不愿意用吸管，那就用移液枪吧，但是一定要注意吸取液体以后要把粘在吸管外的液体挂掉再加入试管，这一步中多一滴或者少一滴对后续会有非常大的影响，所以一定要小心哦，这一点也是一直在强调的，请大家注意。
6、接菌及培养：培养过的肉汤，要离心，再用0.9%的生理盐水清洗，去除培养基的颜色对实验的影响，一定要洗够3遍，不能偷懒，然后从制备好的菌悬液里面吸取200uL加入一支新的生理盐水管，用这支菌悬液来加菌，每管加一滴就够了（这个200uL是长期实验总结出来的经验数据，对我的实验效果最好，不一定全部适用，新手小伙伴不要抄作业哦），然后36℃培养，不要超过20h，否则容易长过了，后面的试管没梯度，没办法做标线，也没办法读数据了。
7、测定：这个也没啥好说的，就按照标准上的要求操作就好，一般来说双平行读出的数据差别不会很大，如果两条标线读数差别很大的话就要反思一下前面的步骤哪里出现了问题，下次要注意哦。
8、试管、容量瓶、烧杯等容器的清洁：实验完成后，所用到的试管、容量瓶、烧杯等容器一定要清洗干净，做到无残留，不然下一次实验就会让你生无可恋，一般我会配制硫酸重铬酸钾溶液来浸泡实验用到的容器，先清洗，再浸泡24小时后再用蒸馏水清洗，最后放到250℃烘箱烘干4小时以上，所以小伙伴们要计算好实验时间和容器的使用量，合理安排资源哦。当然，硫酸重铬酸钾溶液配制起来比较危险，是用浓硫酸配的，配制时一定要做好防护措施，注意安全，而且硫酸重铬酸钾溶液对环境也不是很友好，大家可以试着去找一些玻璃器皿的清洁剂，如果有用的好的品牌的话也欢迎推荐给我哟（我是试用过几个牌子的清洁剂，但效果都不是很理想，所以就一直还在用传统的泡酸法）。标准上注了一点“玻璃仪器使用前,用活性剂(月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即可)对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗,清洗之后200℃干热2h“，看来也是不太推荐使用硫酸重铬酸钾溶液，但是这种活性剂我也没有试过，不知道效果到底如何。
最后的最后，再划一遍重点：
1、配标液的时候注意计算称取的量，一般都是很微少的量，用分析天平称量的时候要准确，最好关门关窗，不要有过多的走动，注意不要交叉污染；
2、注意区分样品的基质，选择相应的适合的方法进行检测（建议拒绝油性基质的样品，因为真心提取不出来），注意看不同方法的检出限，如果样品里生物素含量低于标准检出限，建议退单或者推荐使用非微生物方法进行检测，如果一定要用微生物方法测试，注意规避自己的风险，出具报告时需注明“样品中生物素含量低于标准检出限，结果仅供参考”等意义相近的术语，减少投诉风险；
3、培养基注意一定要过滤，样液制作过程去也要过滤，过滤是实验成功的一个很重要的步骤，一定不能偷懒哦；
4、菌种培养注意不要让菌长过了，保持最佳活性，才能有好结果；
5、定容的时候注意计算稀释倍数，减少稀释过程中出现的误差；
6、实验用的玻璃器皿一定要清洗干净，无残留；
7、稀释倍数、计算公式要搞清楚，不要出现计算或换算方面的错误。
好了，终于完结了使用微生物方法测试三种维生素的系列，如有不正确或漏发的部分欢迎大家指正。
