本方法规定了食品中对乙酰氨基酚等59种化合物检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本方法适用于饮料、茶叶及相关制品等食品中59种化合物单个或多个化合物的定性测定，必要时可参考本方法测定添加成分含量。
2 原理
试样经甲醇或0.1%甲酸-甲醇超声提取，过滤后，上清液供高效液相色谱-串联质谱检测。
3 试剂和材料
除特殊注明外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682 规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯
3.1.2 甲酸（HCOOH）：色谱纯
3.1.3 乙腈（CH3CN）：色谱纯
3.1.4 甲酸铵（CHOONH4）：色谱纯
3.1.5 0.1%甲酸甲醇溶液：取甲酸1 mL用甲醇稀释至1000 mL。
3.1.6 5 mmol/L甲酸铵溶液：称取甲酸铵（3.1.4）0.315g，加水溶解并定容至1000mL。
3.1.7 5 mmol/L甲酸铵溶液（含0.1%的甲酸）：取甲酸1mL，称取甲酸铵（3.1.4）0.315g，加水溶解并定容至1000mL。
3.1.8 0.1%甲酸乙腈：取甲酸1mL，加乙腈稀释至1000mL。
3.2 标准品
对乙酰氨基酚、氨基比林、保泰松、地西泮、罗通定、酮洛芬、甲芬那酸、氯唑沙宗、安替比林、异丙安替比林、非那西丁、盐酸苯海拉明、磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、氯苯那敏、阿司匹林、布洛芬、安乃近、曲安西龙、泼尼松龙、氢化可的松、泼尼松、可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、氟米松、倍氯米松、曲安奈德、氟氢缩松、曲安西龙双醋酸酯、泼尼松龙醋酸酯、氟米龙、氢化可的松醋酸酯、地夫可特、氟氢可的松醋酸酯、泼尼松醋酸酯、可的松醋酸酯、甲基泼尼松龙醋酸酯、倍他米松醋酸酯、布地奈德、氢化可的松丁酸酯、地塞米松醋酸酯、氟米龙醋酸酯、氢化可的松戊酸酯、曲安奈德醋酸酯、氟轻松醋酸酯、二氟拉松双醋酸酯、倍他米松戊酸酯、泼尼卡酯、哈西奈德、阿氯米松双丙酸酯、安西奈德、氯倍他索丙酸酯、氟替卡松丙酸酯、莫米他松糠酸酯、倍他米松双丙酸酯、倍氯米松双丙酸酯、氯倍他松丁酸酯。上述化合物的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量详见附录A中的表A.1，纯度均≥98%。
3.3 标准溶液配制
3.3.1 标准储备液（400 μg/mL）：精密称取各化合物（除阿司匹林外）10 mg分别于25 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）溶解并稀释至刻度，配制成浓度为400 μg/mL的标准储备液；精密称取阿司匹林10 mg于25mL容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇溶液（3.1.5）溶解并稀释至刻度，配制成浓度为400 μg/mL的标准储备液。
3.3.2 混合标准中间液A（200 ng/mL）：分别精密吸取氯苯那敏、氨基比林、罗通定、甲氧苄啶、非那西丁、苯海拉明、异丙安替比林、氟米龙醋酸酯、安替比林、磺胺甲恶唑、甲基泼尼松龙、曲安奈德、曲安西龙双醋酸酯、布地奈德、曲安奈德醋酸酯、倍他米松戊酸酯、地西泮、保泰松、泼尼卡酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松双丙酸酯、倍氯米松双丙酸酯标准储备液（400 μg/mL）（3.3.1）各0.05 mL，置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释并定容至刻度，摇匀，制成浓度为200 ng/mL的标准使用液。
3.3.3 混合标准中间液B（500 ng/mL）：分别精密吸取泼尼松龙醋酸酯、氟轻松醋酸酯、二氟拉松双醋酸酯、安西奈德、阿氯米松双丙酸酯、氟替卡松丙酸酯、莫米他松糠酸酯、氯倍他松丁酸酯、对乙酰氨基酚、泼尼松龙、可的松、倍他米松、地塞米松、氢化可的松丁酸酯、氢化可的松戊酸酯标准储备液（400 μg/mL）（3.3.1）各0.125 mL，置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释并定容至刻度，制成浓度为500 ng/mL的标准使用溶液。
3.3.4 混合标准中间液C（1 μg/mL）：分别精密吸取泼尼松、氢化可的松、氟米松、倍氯米松、酮洛芬、氢化可的松醋酸酯、氟米龙、地夫可特、泼尼松醋酸酯、可的松醋酸酯、甲基泼尼松龙醋酸酯、倍他米松醋酸酯、地塞米松醋酸酯、甲芬那酸标准储备液（400μg/mL）（3.3.1）各0.25 mL，置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀释并定容至刻度，摇匀，制成浓度为1 μg/mL的标准使用溶液。
3.3.5 混合标准中间液D（5 μg/mL）：分别精密吸取氟氢可的松醋酸酯、曲安西龙、氟氢缩松、哈西奈德、安乃近、布洛芬、氯唑沙宗标准储备液（400 μg/mL）（3.3.1）各1.25 mL，置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，制成浓度为5 μg/mL的标准使用溶液。精密吸取阿司匹林标准储备液（400μg/mL）（3.3.1）1.25 mL，置于100 mL容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇溶液（3.1.5）稀释并定容至刻度，摇匀，单独制成浓度为5 μg/mL的标准使用溶液。
3.3.6 混合标准工作溶液：分别准确吸取混合标准中间液A（3.3.2）、混合标准中间B（3.3.3）、混合标准中间液C（3.3.4）和混合标准中间液D（3.3.5）适量，用甲醇（3.1.1）稀释，摇匀，作为系列标准工作溶液S1~S5，浓度依次为混合标准中间液A中各化合物2 ng/mL、4 ng/mL、8 ng/mL、12 ng/ mL、20 ng/ mL；混合标准中间液B中各化合物5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、50 ng/mL；混合标准中间液C中各化合物10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、60 ng/mL、100 ng/mL及混合标准中间液D中各化合物50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、500 ng/mL，临用新配或依仪器响应情况配制适当浓度的混合标准工作溶液。阿司匹林标准曲线需单独用0.1%甲酸甲醇（3.1.5）溶液配制，浓度为50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、500 ng/mL。
4 仪器和设备
4.1液相色谱--串联质谱法：配电喷雾离子源。
4.2 分析天平：感量0.01 mg和0.000 1 g。
4.3涡旋振荡器。
4.4超声仪。
5 分析步骤
5.1 试样的制备
测定阿司匹林用样液：称取研磨后混匀的代用茶、茶叶或摇匀的液体饮料1g（精确至0.0001g），置于50 mL量瓶中，加入0.1%甲酸甲醇溶液（3.1.5）约40 mL，涡旋2 min，超声30 min，放冷至室温，用0.1%甲酸甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过微孔滤膜（0.22μm,尼龙膜），取滤液，根据实际浓度适当稀释至标准曲线线性范围内，供液相色谱-质谱联用仪分析。除不加试样外，均按试样同法操作，作为空白溶液。
测定其他化合物用样液：称取研磨后混匀的代用茶、茶叶或摇匀的液体饮料1g（精确至0.0001g），置于50 mL量瓶中，加入甲醇（3.1.1）约40 mL，涡旋2 min，超声30 min，放冷至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，过微孔滤膜（0.22μm,尼龙膜），取滤液，根据实际浓度适当稀释至标准曲线线性范围内，供液相色谱-质谱联用仪分析。除不加试样外，均按试样同法操作，作为空白溶液。
供测定用样液应在制备后12小时内进样。
5.2 仪器参考条件
5.2.1 色谱条件
5.2.1.1 正模式
a)色谱柱：Acclaim RSLC C18 (2.1×100 mm，2.2 μm)，或性能相当者。
b) 流动相：5 mmol/L甲酸铵溶液（含0.1%的甲酸）（3.1.7）；B相：0.1%甲酸乙腈（3.1.8），梯度洗脱程序见表1。
c) 流速：0.3 mL/min。
d) 柱温：30 ℃。
e) 进样量：2 μL。
f) 运行时间：35 min。
5.2.1.2 负模式
a)色谱柱：Acclaim RSLC C18 (2.1×100 mm，2.2 μm)，或性能相当者。
b)流动相：A相：5 mmol/L甲酸铵溶液（3.1.6）；B相：乙腈（3.1.3），梯度洗脱程序见表2。
c)柱温：30 ℃。
d)流速：0.3 mL/min。
e)进样量：2 μL。
f) 运行时间：16 min。
5.2.2质谱条件
a) 离子源：电喷雾离子源（ESI）
b) 扫描方式：多反应监测模式（MRM）
c) 干燥气、雾化气、鞘气等均为高纯氮气或其他合适气体，使用前应调节相应参数使质谱灵敏度达到检测要求，毛细管电压、干燥气温度、鞘气温度、鞘气流量、碰撞能量等参数应优化至最佳灵敏度，监测离子对和定量离子对等信息详见附录B。
注：（1）方法提供的监测离子对等测定条件为推荐条件，各实验室可根据所配置仪器的具体情况作出适当调整；在样品基质有测定干扰的情况下，可选用其他监测离子对。
（2）为提高检测灵敏度，可根据保留时间分段监测各化合物。
5.3 定性测定
按照高效液相色谱-串联质谱条件测定试样和标准工作溶液，记录试样和标准溶液中各化合物的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度，记录浓度相当的试样与标准工作溶液中相应成分的相对离子丰度。当试样中检出与59种化合物中某标准品质量色谱峰保留时间一致的色谱峰（变化范围在±2.5%之内），并且相对离子丰度（k）允许偏差不超过表3规定的范围，可以确定试样中检出相应化合物。
表3 定性时供试品溶液中离子相对丰度的允许偏差范围
5.4定量测定
5.4.1标准曲线的制作
将混合标准工作溶液（3.3.6）分别按仪器参考条件（5.2）进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积。以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
5.4.2试样溶液的测定
将试样溶液（5.1）按仪器参考条件（5.2）进行测定，得到相应的样品溶液的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的浓度。
6 结果计算
按下式（1）计算试样中待测物的含量：
式中：
X - 试样中各待测物的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；
c - 从标准曲线中读出的供试品溶液中各待测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng /mL）；
V - 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
m -试样溶液所代表的质量，单位为克（g）；
f- 稀释倍数；
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
7 检测方法的灵敏度、精密度
7.1 灵敏度
当样品取样量为1 g，定容体积为50mL时，本方法中各化合物的定量限如下：
安替比林、氨基比林、保泰松、倍氯米松双丙酸酯、倍他米松双丙酸酯、倍他米松戊酸酯、苯海拉明、布地奈德、地西泮、非那西丁、氟米龙醋酸酯、磺胺甲恶唑、甲基泼尼松龙、甲氧苄啶、罗通定、氯倍他索丙酸酯、氯苯那敏、泼尼卡酯、曲安奈德、曲安奈德醋酸酯、曲安西龙双醋酸酯、异丙安替比林定量限为0.1mg/kg；
泼尼松龙醋酸酯、氟轻松醋酸酯、二氟拉松双醋酸酯、阿氯米松双丙酸酯、安西奈德、氟替卡松丙酸酯、莫米他松糠酸酯、氯倍他松丁酸酯、对乙酰氨基酚、泼尼松龙、可的松、倍他米松、地塞米松、氢化可的松丁酸酯、氢化可的松戊酸酯定量限为0.25mg/kg；
氢化可的松、泼尼松、氟米松、倍氯米松、酮洛芬、氟米龙、氢化可的松醋酸酯、地夫可特、泼尼松醋酸酯、可的松醋酸酯、甲基泼尼松龙醋酸酯、倍他米松醋酸酯、地塞米松醋酸酯、甲芬那酸定量限为0.5mg/kg；
曲安西龙、氟氢缩松、氟氢可的松醋酸酯、哈西奈德、阿司匹林、布洛芬、氯唑沙宗、安乃近定量限为2.5mg/kg。
7.2 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
质谱参考条件
正模式
a)电离模式：ESI
b)检测方式：动态多反应离子监测（dMRM）
c)电离电压：4.0 kv（正离子扫描）；
d)干燥气流速：7 L/min
e)干燥气温度：325 ℃
f)鞘气流速：11 L/min
g)鞘气温度：350 ℃
h)雾化器流量：40 psi
负模式
a)电离模式：ESI
b)检测方式：多反应离子监测（MRM）
c)气帘气压力 （CUR）：10.0psi
d)碰撞气（CAD）：medium
e)离子化电压（IS）：-4500.0V
f)雾化温度(TEM)：400.0℃
g)雾化气 （GS1）：30.0psi
h)辅助气（GS2）：30.0psi
i)入口电压（EP）：-10.0V
j)出口电压（CXP）：-15.0V
