各种环境样品检验方法和卫生标准的制定，是卫生微生物学重要的研究内容之一。通过这些方法和标准，可以检测并判断水、空气、土壤、食品、日常用品，以及各类公共场所的卫生状况。了解这些环境条件和物品卫生状况的目的，一方面是为预防致病性微生物通过这些媒介感染人群，引起疾病的暴发流行；另一方面为了避免不符合质量或卫生标准的食品、药品、化妆品等流入市场，给广大消费者造成损失或带来危害。但从样品中直接检测目的病原微生物有一定难度，原因是在环境中病原微生物数量少。种类多、生物学性状多种多样，检验和鉴定方法比较复杂。有鉴于此，需要寻找某些带有指示性的微生物，这些微生物应该在环境中存在数量较多，易于检出，检测方法较简单，而且具有一定的代表性。
依据这些指示性微生物检出的情况，可以判断样品被污染的程度，并间接指示致病微生物有无存在的可能，以及对人群是否构成潜在的威胁。指示菌的检测为安全提供了重要保障，这已由多年来的实践所证实。
当然，一个项目的卫生标准关系到物理学、化学、毒理学、微生物学等多项综合性指标，卫生微生物学标准只是其中一部分，但它却与人群的健康和生活质量的提高密切相关，因此是十分重要的。
第二部分、指示菌的概念与选择标准
一、指示菌的概念
指示菌（indicator bacteria）（或称指标菌）是在常规卫生监测中，用以指示检品卫生状况及安全性的指示性微生物。常规检验指示菌的目的，主要是以卫生指示菌在检品存在与否以及数量的多少为依据，对照国家卫生标准，对检品的饮用、食用或使用的安全性做出评价。
依据目前实际应用情况可将其分为三种类型：
第一种类型的指示菌是为了评价被检样品的一般卫生质量、污染程度以及安全性，最常用的是菌落总数、霉菌和酵母菌数。
第二种类型是特指粪便污染的指示菌，主要指大肠杆菌和大肠菌群，其它还有肠球菌、亚硫酸盐还原梭菌等。它们的检出标志着检品受过人、畜粪便的污染，而且有肠道病原微生物存在的可能性。
第三种是其它指示菌，包括某些特定环境不能检出的菌类（如特定菌、某些致病菌、或其它指示性微生物），这些指示菌，在不同的样品中有不同的指示意义，将在后面分别叙述。
二、指示菌的选择标准
（一）一般卫生指示菌的选择标准
作为一般卫生质量和安全性评价的指示菌，依据不同的样品有不同的目的要求，总的选择原则是易于检出，检验方法比较简单、方便，有一定的代表性等。
（二）粪便污染指示菌的选择标准
作为理想的粪便污染指示菌，一般认为应具备下列条件：
1．是人及温血动物肠道正常菌群的组成部分，而且在数量上占有优势。
2．在被人或动物粪便污染的样品中易捡出，未被粪便污染的样品中无此种菌存在。
3．排出体外后，在外环境中存活时间与肠道致病茵大致相似或稍长。
4．如作为饮用水的指示菌，对氯的抵抗力应不低于肠道致病菌或略强，而且进入水中不会再繁殖。
5．检验方法简便，易于检出和计数。
实际上，没有任何一个菌种能完全满足上述要求，但有少数细菌可以接近这些要求。
第三部分、常用的指示菌
一、一般卫生状况指示菌
（一）菌落总数
1．菌落总数的概念：菌落总数（aerobial plate count ）是指被检样品的单位重量（g）、容积（ml）、表面积（cm2）或体积（m3）内，所含有的能在某种培养基上经一定条件培养后生成的细菌菌落总数。
2．菌落总数的卫生学意义：菌落总数是判定检样被细菌污染程度的指示菌。在饮用水、水源水、食品、药品、化妆品、物体表面、室内空气等，以及一些进出口贸易品中，都将菌落总数的限量规定作为卫生标准之一。
3．菌落总数的检验原则：菌落总数所用培养基、培养温度、培养时间的差异会影响到菌落计数的结果。因此，严格遵照国家规定的检验方法中的操作条件很重要，以便获得始终可比的结果。检测时先将固体或液体样品作10倍系列稀释，稀释倍数视样品性状和既往检测经验而定。标准检验方法多用倾注培养法，但依据情况和需要也可选用平板表面涂布法及平板表面点滴法。
平板表面涂布法较倾注法的优点是，菌落生长在平板表面，便于观察和识别，同时检样中的细菌不至因倾注融化的热琼脂时遭受损伤，从而降低菌落数；但此法使用的样品量仅为倾注法的1／10～ l／5，使代表性受到一定影响。平板表面点滴法与涂布法相似，只是用标定好的微量滴管（每滴相当于0.025ml），将检样稀释液滴加于琼脂平板表面划定的区域内，仅需培养6～8h即可计数，具有决速、节省人力、物力的优点。但因所用检样量少，同样影响到代表性，故含菌量少的样品，不宜采用此法。
倾注法和表面涂布法在菌落计数时都选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数计数之用。
应该说明的是，菌落总数的测定，一般采用平板计数琼脂培养基，在37℃有氧条件下培养，因此不能测出每克或每毫升检样中实际的总活菌数。因为厌氧菌、微需氧菌、嗜冷菌或嗜热菌以及有特殊营养要求的细菌，在此条件下或不能生长或不能很好地生长。因此用目前方法所获得的结果，只能包括需氧或兼性厌氧的、嗜中温的、能在普通平板计数琼脂上生长的一群细菌的菌落数，它必然低于实际存在的活菌数，也不能表明污染菌的种类。
又由于检品中的细菌细胞可以是单个、成对、成链状，或成堆的形式存在，因此在琼脂平板上出现的菌落不一定都是单个菌细胞形成的菌落，也可能由非单个细胞形式分裂增殖堆积而成，所以不宜报告为细菌总数，而以报告单位重量、容积、表面积或体积内菌落形成单位数（coloy forming unit，CFU）更科学合理。
（二）霉菌和酵母菌数
1．霉菌和酵母菌数概念：霉菌和酵母菌数是指检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含的霉菌和酵母菌菌落数。
2．霉菌和酵母菌数的卫生学意义：由于霉菌和酵母菌营养要求较低，存活力强，在pH值、湿度、温度偏低；含盐、含糖量高；以及含抗生素的环境中均可生长。可以造成食品、药品或其它日常用品发霉变质，散发出难闻的气味，有些霉菌还可以产生毒素，从而使产品失去食用或使用价值，甚至造成真菌毒素中毒症。因此一些样品将霉菌和酵母菌也作为评价卫生质量的指标菌，并以霉菌和酵母菌数作为判断检样被霉菌和酵母菌污染程度的标志，同时制定了相关检品的霉菌和酵母菌数限量标准。
3．检验原则：霉菌和酵母菌计数常用的培养基，我国多采用高渗察氏培养基、加有抗生素的马铃薯一葡萄糖琼脂培养基、孟加拉红（虎红）培养基。菌落计数应选取菌落数在15～150之间的平板作为霉菌和酵母菌数测定计数之用。目前我国在糕点类和奶油类食品、药品、化妆品等检样中都规定了霉菌和酵母菌的检出限量标准。
二、粪便污染指示菌
（一）大肠杆菌和大肠菌群
1885年Escherich分离出大肠杆菌，并认为是人和温血动物肠道中正常菌群的重要组成部分，为其后以该菌作为环境被粪便污染的指示菌奠定了基础。1892年Schardinger首先提出以大肠杆菌作为水源中病原菌指示菌的建议。1893年Theobald Smith指出，大肠杆菌因普遍存在于人和动物的肠道内，所以若在肠道外的环境中发现，就可以认为是被人和动物的粪便所污染。从此便开始应用大肠杆菌作为水源被粪便污染的指示菌。1937年Jordan H．E．提议在卫生细菌学上用“大肠菌群”代替“大肠杆菌”，这一建议受到了各国学者的重视，便逐步以“大肠菌群”代替了“大肠杆菌”作为水质和食品被粪便污染的指示菌。目前，世界各国仍采用“大肠菌群”作为粪便污染的指示菌。
1． 大肠杆菌
大肠杆菌以具有β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶为其特征。多数菌种可以在44℃～45℃培养条件下生长。具有发酵乳糖产酸产气，分解色氨酸产生吲哚等生化特点。
大肠杆菌在人及动物粪便中大量存在，新鲜粪便中可达每克109，因此大肠杆菌若在环境样品中检出，可以认为该样品受到了人或动物粪便的污染或用以判断水质消毒处理上的效果不佳。
大肠杆菌虽是较理想的粪便污染指示菌，但是由于它的鉴定方法比较复杂，有些快速检验法，也尚未作为标准方法应用，所以，直接用其作为粪便污染指示茵的样品不多。我国在药品卫生细菌学检验中，口服药类规定不得检出大肠杆菌。
2．大肠菌群（总大肠菌群）
大肠菌群或称总大肠菌群是指一群能在35℃～37℃条件下24～48h内发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。大肠菌群不是细菌分类学上的一个名称，而是人为议定的名词。符合这些条件的肠杆菌科细菌主要包括4个菌属：埃希氏菌属，在此菌属中与人类生活密切相关的仅有一个种，即大肠杆菌；其次有柠檬酸杆菌属，其代表种有弗劳地拘檬酸杆菌；克雷伯氏菌属，代表种为肺炎克雷伯氏菌；肠杆菌属，代表种有阴沟杆菌和产气杆菌。
3.耐热大肠菌群（粪大肠菌群）
耐热大肠菌群或粪大肠菌群即能在44℃～45℃发酵乳糖的大肠菌群。耐热大肠菌群的主要组成菌属与总大肠菌群相同，也包括上述4个菌属，但主要组成是埃希氏菌属；克雷伯氏菌属、柠檬酸杆菌属及肠杆菌属所占数量较少，因为其部分菌种（尤其是来自环境的菌种）不适于在44℃～45℃温度下生长。
（二）肠球菌
肠球菌的生物学特性：肠球菌是人及动物肠道中正常菌群，自然界分布广泛，常存在于水、土壤、空气中。在人粪中所占数量少于大肠杆菌，每克粪便约含108，在动物粪便中所占数量较高。
（三）亚硫酸盐还原梭菌
亚硫酸盐还原梭菌 的代表种是产气荚膜梭菌，是人和动物特别是食草动物肠道内的常住菌，数量少于大肠杆菌，每克粪便约为105～106，在自然界有广泛分布，主要在土壤中；污水、粪肥、空气或尘埃中也有其存在。可被作为粪便污染的指示菌。这类细菌的特点是厌氧生长、能形成芽胞、能还原亚硫酸盐为硫化物。对含氯消毒剂及外界不良环境有较强的抵抗力，在外环境中存活时间较长。所以若检样中产气荚膜梭菌被大量检出而大肠菌群数很少时，则表示检品曾受过粪便污染，但不是新近的污染，而表示有陈旧性污染。故可以与大肠菌群互补监测。常被作为水或土壤卫生细菌学检验中的指标菌。有些国家在食品中也规定了该菌检出的限量标准。
三、其他指示菌
（一）特定菌与不得检出的致病菌
1．概念特定菌：是指在某些检品中规定不得检出的菌类，规定的原则是从这些检品的使用安全性出发，依据国内情况，参考国际标准而制定的。其中包括非致病菌（或条件致病菌），以及致病菌。例如药品、化妆品都规定了特定菌检验的限制范围，而且根据给药途径不同，对不同的药品都做了具体规定。
2． 常用的致病菌指标菌
（1）金黄色葡萄球菌；
（2）铜绿假单胞菌通称绿脓杆菌；
（3）沙门氏菌；
（4）志贺氏菌；
（5）链球菌。
（二）特殊环境的卫生指标菌
除水、空气、土壤、食品等为了了解其卫生状况和安全性制定了指示菌及其限量标准外，还有一些领域也需要使用指示菌，在消毒灭菌效果的监测中指示菌的应用尤为重要。如判断压力蒸气灭菌效果，常以嗜热脂肪杆菌芽胞为指示菌；判断电离辐射灭菌或消毒效果，常选用抗辐射性强的短小芽胞杆菌为指示菌；判断环氧乙烷灭菌或消毒效果，以枯草杆菌黑色变种芽胞为指示菌。通过检验上述指示菌的存活情况，来判断灭菌或消毒效果及被消毒物品的使用安全性。
（三）肠道病毒的指示微生物
由于大肠菌群对氯等饮水消毒剂的耐受力较某些病毒（如柯萨奇病毒、肝炎病毒）弱，因此认为大肠菌群不是水中病毒适宜的指示菌。存在于水中的病毒型别很多，不可能逐一检查，为便于水中病毒污染或消毒的研究工作，很多学者进行了关于选择水中病毒指示微生物的工作，理想的条件是：①检验方法简单；②操作安全；③在被人粪肠道病毒污染的环境中一定存在，其存在数量应等于或大于肠道病毒的数目；④对于消毒剂和外环境的抵抗力应与肠道病毒一致或稍强。报告较多的是对脊髓灰质炎病毒和大肠杆菌噬菌体的研究。
第四部分、卫生微生物检验原则
一、样品的采集与送检
（一）样品的采集
卫生微生物检验的目的是对水、食品、室内空气及其它物品作出卫生学评价，涉及的对象主要是物品和生活环境。为保障人群的安全及执行卫生法的严肃性，检查结果应准确客观。样品的采集、保存和运送是否恰当，直接关系到检验结果，是做好检验工作的前提。
对不同的样品有不同的具体采样要求，原则上需注意以下几方面的问题：
1．采集的样品必须有代表性，采样量、采样部位应依检样归属类别的标准要求执行，注意采用随机抽样法，并按批号抽样。
2．由于检测的是样品实际污染状况，因此应严格避免由于采样对检品造成新的污染。所有采样用具、容器需严格灭菌，并以无菌操作采样。
3．固体粉末样品，应边取边混合；液体样品应振荡混匀；涂擦取样的棉拭子在揩后剪断，投人稀释液充分振摇，作为原液。
4．注意对样品的详细标记，以防错乱。
（二）样品的送检与保存
1、为避免样品变质和样品中微生物的增殖或死亡，原则上送检时间越快越好。
2、不能及时送检或检验的样品，如系食品和水样一般要求在低温条件下保存；药品和化妆品仅要求放在室温阴凉干燥处，不必冷藏或冷冻，以防引起产品质量的变化。
3、样品在检验前应保持原包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。液体样品要保证包装完好，防止运输中外溢或散漏。
二、样品的检验与报告
（一）样品的检验原则
1．检验样品用量按各类样品标准要求执行。
2．检验过程中，所用器材、材料应事先灭菌备用，检验应在无菌室或生物安全柜内进行，防止微生物的再污染或扩散。
3．如果一个样品需做多种分析，如微生物、化学、毒理等，宜先取出部分样品做微生物检验，其余部分留做其它检验用。
4．供试品为固体、非水溶性软膏等，注意需均质化后再行稀释，供试品制备成供试液后，应在均匀状态取样。
5．凡有防腐剂、抗生素、消毒剂或其它抑菌物质的检品，检验时应对其抑菌作用予以去除，可采取中和法、滤膜过滤法、稀释法等。还应考虑到采取适当步骤，使受环境或消毒剂损伤的菌株得以复苏，如采用较低温度下的预培养等，以提高检出率。
6．做到检验方法和实验室操作程序的标准化，以保证实验结果的可靠性与可比性。
（二）结果报告
1．细菌、霉菌、酵母菌菌落总数的测定，一般样品以1g或lml为单位的菌落数表示；表面涂擦采样或空气采样以 1cm2或1m3为单位的菌落数表示，例：CFU/g（ml）或CFU/cm2（m3）。
2．特定菌或致病菌检验报告，一般以1g或1ml为单位报告“检出”或“未检出”。
3．最近似数（MPN）的报告：最近似数或译为最可能数。当样品中准备检测的某种细菌数极低（如低于每g含10个菌），且又混杂在其它细菌之中的时候，无法采用平板菌落计数的方法进行计数，在这种情况下MPN法在计算菌数，特别是极少的菌数时很有用处。最常用的是水和食品中大肠菌群的计数，其它还有用于粪大肠菌群、沙门氏菌、葡萄球菌、产气荚膜梭菌等的计数。
