A: 4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷按以下规程用于β-葡萄糖苷酶检测，不过缓冲溶液可以配合受检的酶溶液的pH值进行调整。
所需材料:
缓冲溶液: - 0.1 M 醋酸钠缓冲溶液(pH 4.0)。
酶底物溶液: 4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（10mM）。
称量301毫克的4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，加入150 ml耐热烧杯中，加入95毫升0.1M的醋酸钠缓冲溶液(pH 4.0)。搅拌溶液直至底物完全溶解（大约10分钟）。用0.1M的醋酸钠缓冲溶液(pH 4.0)调节体积至100毫升。加入0.02 g叠氮钠以防止微生物污染。将溶液储存于一个密闭的Duran瓶中。日常使用时取10毫升加入聚丙烯试管中。注意不要频繁从酶底物储备液中取用。 所有容器都应置于4摄氏度下储存。
酶制备液:
用GILSON的微量移液器精确将1.0毫升均匀的酶悬浮液转移到一个100毫升的容量瓶中，然后用0.1M的醋酸钠缓冲溶液(pH 4.0)定容。接下来按照0.5毫升酶溶液和4.5毫升缓冲液的比例（10倍）稀释酶制备液，混合均匀，重复上述步骤直至获得适合分析的稀释液。
上述操作推荐使用Gilson移液器，预设0.5ml，用于转移酶制备液；Eppendorf多道移液器用于转移4.5ml缓冲液（5道设置为2.5毫升，4道设置为2毫升）。
检测过程:
40摄氏度下，预培养置于玻璃试管(16 x 100 mm)中的酶底物溶液（0.2毫升）5分钟
40摄氏度下，预培养酶稀释溶液（约5毫升）5分钟。
严格按时间间隔（大约15秒），往含有0.2毫升底物溶液的试管底部加入0.2毫升酶溶液，剧烈震荡混合试管内容物，然后培养试管（一式四份）10分钟左右。
培养结束前，加入3.0毫升2%的磷酸三钠溶液(pH 12.0)终止反应，并剧烈搅拌。
准备反应空白溶液（一式两份），将3.0毫升2%的磷酸三钠溶液(pH 12.0)加入0.2毫升底物溶液中，剧烈搅拌。然后加0.2毫升酶溶液，剧烈搅拌。
按以下步骤测量吸光度值(400 nm):
- 用蒸馏水校正分光光度计的零点
- 检测反应空白样相对于水的吸光度，并记录(仅供参考).
- 用蒸反应空白样校正分光光度计的零点
- 检测所有其它溶液相对于反应空白样的吸光度
活性计算公式如下:
1个单位酶活性，是每分钟在最佳pH和40摄氏度下将1微摩尔PNP底物水解成pNP和底物所需要的酶的数量。
按以下公式进行计算:
Units/mL = (ΔE400 /10)×(3.4/0.2）× (1/18.1)×（100/1.0）×稀释体积
= ΔE400×9.39×稀释体积
此处:
ΔE400 = 吸光度 (反应) – 吸光度(空白)
培养时间 = 10分钟
细胞总体积 = 3.4 毫升
检测等分 = 0.2 毫升
对硝基酚在2%磷酸三钠溶液中的EmM值 = 18.1
萃取体积 = 总体积为100毫升的萃取原液中有1.0毫升的酶
稀释体积 = 萃取原液进一步稀释体积
注意:- 对于40 Units/ml的β-葡萄糖苷酶溶液来说，进一步稀释“萃取原液”意味着稀释至10倍。
