金黄色葡萄球菌肠毒素是世界性卫生问题，乳品尤其是原料乳极易受到金黄色葡萄球菌的污染。2009年欧洲食品安全局报道了5550例食物中毒事件，导致49000人患病、46人死亡，其中293例由金黄色葡萄球菌感染引起，是欧洲最常见的4种引发食物中毒的病原菌之一，由此可见金黄色葡萄球菌的危害极大。生乳及乳制品污染中比较常见的另一种食源性致病菌是沙门氏菌(Salmonella spp.)，受其感染的人和动物会出现伤寒、副伤寒等病症，沙门氏菌一旦进入血液组织，则会导致系统性炎症，甚至死亡。1994年美国暴发了由沙门氏菌导致的冰淇淋污染，约有22400人患病。
一个中等规模的乳品工厂，一天生产的不同类产品至少有上百个批次，加工过程中的原料、过程品、终产品、生产环境都需要检测金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。GB 4789.1-2016规定同一批次需采集5个样品进行检测，检测量每天高达几百个。根据GB 4789.4-2016和GB 4789.10-2016，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的定性判定至少需要3d，该方法操作较繁琐、耗时长，不能满足检测时效的需求。由于低温奶保质期较短，我国正在推动的国家优质乳工程，在对产品要求提高的同时也对检测技术提出了新的挑战。
今天介绍一项创新检测体系优化了样品前处理过程，并引入了荧光定量PCR分子检测技术，可以在24h内完成金黄色葡萄菌和沙门氏菌的增菌和检测。进行了大量验证试验和实际检测后，结果表明此检测体系稳定性好，准确性高，缩短了整体检测时间，并降低了检测成本，为乳品致病菌检测技术的创新发展提供了研究基础。
实验思路
常见致病菌qPCR的检测限一般在103CFU/mL以下，而增菌后浓度一般可达105CFU/mL以上，增菌后多个样本增菌液混合提取核酸处理检测相当于稀释多倍（5个样本增菌液混合相当于稀释5倍），一般会高于检测限，从理论上来讲，采用五合一PCR检测的方式能够满足国标方法检测的需求。
实验材料
1. 样本
样品取自光明乳业华东中心工厂生产线，主要为发酵乳（包括风味发酵乳、果味发酵乳、畅优发酵乳、健能发酵乳、大果粒发酵乳和莫斯利安发酵乳）和部分鲜奶制品（包括无乳糖牛奶、优倍牛奶、纯牛奶与致优全鲜乳）。
2. 菌株
金黄色葡萄球菌阳性菌株：ATCC27217；沙门氏菌阳性菌株：CMCC50333。
3. 主要试剂
金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）LR70501、沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）LR70601，购自北京良润生物科技有限公司。
4.主要仪器
实时荧光PCR仪：雅睿MA-6000P；恒温培养箱、离心机（2mL、5mL、7mL）、掌式离心机（0.2mL 8联管）、金属浴、涡旋混合器、移液器（10μL、100μL、1000μL）及吸头、离心管（2mL、5mL、7mL）、PCR反应管（0.2mL）等。
实验方法
1. 验证实验
同一样品的5次采样为1组，其中取1~5次进行金黄色葡萄球菌/沙门氏菌添加（101CFU），使用国标增菌培养基增菌后，分别取1mL混合后进行基因组提取，5次采样的增菌培养基按照国标方法继续进行后续鉴定，并记录鉴定结果（共30组，只记录组检测结果）。
2. 样本实验
在工厂进行实际样本（发酵乳及部分其他鲜奶制品）的检测，采用五合一PCR的方法（同时以国标方法来做对比）记录每组检测结果，共1596组发酵乳、912组鲜奶制品。在前两周的检测中，每天都从样品中取两组，从中各取一份样品进行阳性添加并记录检测结果（共30组）。
结果与分析
1.验证结果分析
金黄色葡萄球菌五合一PCR验证实验结果表明，五合一PCR检测与普通国标法检测结果没有显着性差异，不会出现漏检的现象，如表1。
表1 金黄色葡萄球菌五合一PCR验证
注：*1表示该样品的5次采样中取n次做阳性添加；*2表示1个样品的5次采样按照国标法检测，有一次为阳性该样品即为阳性；*3表示1个样品的5次采样增菌后各取1mL混匀后进行基因组提取检测，结果即为样品结果。
沙门氏菌五合一PCR验证实验结果表明，五合一PCR检测与普通国标法检测结果没有显着性差异，不会出现漏检的现象，如表2。
表2 沙门氏菌五合一PCR验证
注：*1表示该样品的5次采样中取n次做阳性添加；*2表示1个样品的5次采样按照国标法检测，有一次为阳性该样品即为阳性；*3表示1个样品的5次采样增菌后各取1mL混匀后进行基因组提取检测，结果即为样品结果。
2. 样本实验结果分析
在1596组发酵乳及912组鲜奶制品的金黄色葡萄球菌检测实验中，五合一PCR检测与国标法检测结果没有显着性差异（国标法发酵乳金黄色葡萄球菌检测有55组疑似阳性，但后续验证结果为金黄色葡萄球菌阴性；共30组样品的阳性添加用两种方法检测都为阳性），如表3所示。
表3 金黄色葡萄球菌实际样本检测
在1596组发酵乳及912组鲜奶制品的沙门氏菌检测实验中，五合一PCR检测与国标法检测结果没有显着性差异（国标法沙门氏菌检测有38组疑似阳性，但后续验证结果为沙门氏菌阴性；共30组样品的阳性添加用两种方法检测都为阳性），如表4所示。
表4 沙门氏菌实际样本检测
结论
今天探索了一种乳品中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌快速检测体系，采用Real-Time PCR方法，对一组样本5次采样的前增菌液混合后进行基因组提取，使用金黄色葡萄球菌和沙门氏菌核酸检测试剂盒进行检测，极大的缩短了检测时间，减小了工作强度。
经过验证实验以及实际样品加标实验，五合一PCR检测与常规国标检测结果上并没有显着差异，不会造成漏检。
通过对1596组发酵乳及912组鲜奶制品的应用实验，在检测发酵乳与鲜奶制品时，五合一PCR检测与常规国标检测相比，耗时更少，准确度更好，工作强度更低。
目前，有研究人员探索了食品中多种致病菌的同步增菌技术，未来有希望实现由一种培养基来实现多种致病菌的同步增菌，而多重PCR也可实现多种致病菌的同时检测，技术的发展将会使致病菌的检测更加便捷。
近年来，国际标准化组织（ISO）已将PCR方法制定为检测食源性致病菌的标准化方法。不久的将来，荧光定量PCR有望能够在沙门氏菌及其他致病菌快速检测上实现方法的标准化。建议食品检验方法应剥离于安全标准之外（即非强制性），给予选择使用快速检验方法的合理空间。
随着乳制品质量要求和营养要求的不断提高，对相应的检测技术也提出了更高的要求。随着科技的不断发展，乳制品中致病菌的检测灵敏度、特异性、准确性、便捷性和及时性等方面将得到不断的发展和改善。
