不知道现在的小伙伴们测试食品中的叶酸、维生素B12和游离生物素都是用什么方法呢？是比较繁琐的传统的微生物方法呢，还是比较简便快速的试剂盒法呢，估计很多小伙伴们都选用试剂盒法了，毕竟时代在进步，检测水平也在不断提升，但是就像电视机的问世并没有取代收音机一样，传统的微生物方法虽然繁琐，耗时较长，但是灵敏度高，不容易漏检，所以还是有它的优势在，所以下面我就着重的跟小伙伴们分享一下使用微生物方法（光密度法）测试食品中叶酸的过程中可能会出现的问题以及一些注意事项，希望能给大家提供一些帮助或者拓宽一下大家的检测思路。
叶酸的测定
叶酸的测定一般常用的有两种方法，分别是GB5413.16-2010和GB 5009.211-2014，前者主要针对的是婴幼儿食品，尤其是婴幼儿乳制品，后者的检测对象比较宽泛，适用于多种类型的食品，比如水果蔬菜等天然食品，还有淀粉含量比较高的米粉类制品，以及叶酸含量较高的营养强化剂等，所以面对不同的样品，要选择合适的标准进行测试。
测定原理之类的标准上都有，测试之前仔细看清楚就行，这里就不再赘述了，下面就按照日常的测试流程给大家梳理一遍，里面会提及常见的问题及注意事项。
1、标准溶液的制备：标准品一定要准确称量，而且计算需要量的时候要考虑标准品含水量之类的因素，不要算错了，标准溶液是标杆，它如果出现错误，后面的每一步就都没有意义了，配置的时候记得加氨水，叶酸标准品是溶于碱性环境的，不加氨水溶解不完全，建议除了工作液现用现配外，储备液和中间液先都一起配好，贴好试剂标签，放4℃冰箱保存，还有要注意，配置标准溶液时不要称样，称样的时候不要配置标准溶液，以防交叉污染。
2、样品的制备以样液的提取：GB 5413.16-2010里面需要配制的磷酸缓冲液有四种，但其实实际用下来感觉没什么区别，所以平时常用的是含有0.05mol/L抗坏血酸的磷酸缓冲液（5413和5009通用），如果使用5413的方法，样品是比较容易溶解的乳粉类，就可以直接称量到容量瓶里面进行定容，如果样品是含淀粉较多的面条或米粉类，先称取样品到洁净的150mL小烧杯里，加入30mL含有0.05mol/L抗坏血酸的磷酸缓冲液，121℃灭菌15min，冷却到室温后加入1mLα-淀粉酶溶液和1mL木瓜蛋白酶溶液，（这里我没有加鸡胰酶，因为我个人认为鸡胰酶适用于酶解天然物质中含有的天然叶酸，像婴幼儿米粉之类的样品都经过叶酸强化了，天然叶酸含量已经远远低于强化的叶酸含量，所以用不用鸡胰酶分解已经意义不大，如果是天然面条或米粉，可以按标准加4mL鸡胰酶）然后就放到36℃培养箱里过夜培养，不要超过24h，然后105℃水解5min（这一步是降解前面加入的酶，去除酶对实验的影响）调pH，用水定容，然后进行后续提取操作。这里要注意区分样品的基质，油性的样品基本不适用微生物方法来测叶酸的含量，我试过很多次，感觉无法从油水分离的东西里面提取叶酸，如果大家有好的方法，欢迎推荐并讨论哦~
如果使用5009方法，样品是天然物质的一定要趁新鲜的时候取样，而且要快速，当天取样当天操作，减少叶酸损失，样品是坚果或者大米之类的，需要先粉碎成粉末状，不然提取不完全，样品是营养强化剂的，注意计算稀释倍数，以免稀释过程中出现错误，多次稀释时也要注意减少误差，不然对后面的实验结果产生较大的影响。提取过程跟5413差不多，该加酶的加酶，该过滤的过滤。
3、培养基的制备：叶酸测定用培养基最好买进口的（推荐BD家的，不是我不支持国货，国产培养基不知道是营养物质不够还是怎么的，就是测试效果不好，为了获得不错的实验结果还是选择BD的吧），然后就是煮沸的时候多让它沸腾几次，让培养基完全溶解，冷却到手能拿住烧杯的温度，过滤，过滤，过滤，重要的事情说三遍，一定要过滤煮沸过的培养基，去除杂质，不然有可能整条标线都会废掉，然后让过滤过的培养基在冰箱中过夜，第二天再用。
4、菌种的制备：鼠李糖乳杆菌（之前也叫干酪乳杆菌）活性很好，不需要像标准中叙述的先划平板再接肉汤那么麻烦，直接肉汤培养就好，先做一管磁珠，-70℃冻干保存，用之前直接挑一个磁珠接入乳酸杆菌肉汤，36℃培养不要超过20小时，否则菌会长过，活性太强，影响结果准确性，这个有磁珠的肉汤管不要丢，可以在4℃冰箱中保存一个月，下一次接菌直接从含有磁珠的肉汤管里面分别吸取一滴分别加入两管新鲜的乳酸杆菌肉汤，这样一来是备用，二来是保证下次吸取的菌液活性较好，如果大家觉得一个月时间有点太久，可以使用半个月就重新接一个磁珠。
5、标准曲线的制作：这个就完全按照标准来做就好，注意5413和5009的标液浓度不一样，制作标准曲线时加入的量也不一样，两种方法的灭菌温度都是121℃，5min，15分钟太久了，会使培养基变色，影响实验结果，灭菌后要迅速冷却试管，可以放在冰水里面冷却，不然培养基颜色也会变深，影响实验结果。一般标准曲线和样品测试管我都会做两平行，保证结果准确性和重现性，我觉得双平行是在实验准确性和可行性之间一个比较好的平衡点。加水、培养基、标液和样液的时候推荐使用吸管法吸取，最好用洗耳球吸取，其次是用电动枪吸管法，当然这两种方法非常考验臂力，基本做完实验两条胳膊已经麻木了，但是这样操作误差比较小，最后的实验结果会比较准确，如果你实在不愿意用吸管，那就用移液枪吧，但是一定要注意吸取液体以后要把粘在吸管外的液体挂掉再加入试管，这一步中多一滴或者少一滴对后续会有非常大的影响，所以一定要小心哦。
6、接菌及培养：培养过的肉汤，要离心，再用0.9%的生理盐水清洗，去除培养基的颜色对实验的影响，一定要洗够3遍，不能偷懒，然后从制备好的菌悬液里面吸取40uL加入一支新的生理盐水管，用这支菌悬液来加菌，每管加一滴就够了（这个40uL是长期实验总结出来的经验数据，对我的实验效果最好，不一定全部适用，新手小伙伴不要抄作业哦），然后36℃培养，不要超过20h，否则容易长过了，后面的试管没梯度，没办法做标线，也没办法读数据了。
7、测定：这个也没啥好说的，就按照标准上的要求操作就好，一般来说双平行读出的数据差别不会很大，如果两条标线读数差别很大的话就要反思一下前面的步骤哪里出现了问题，下次要注意哦。
8、试管、容量瓶、烧杯等容器的清洁：实验完成后，所用到的试管、容量瓶、烧杯等容器一定要清洗干净，做到无残留，不然下一次实验就会让你生无可恋，一般我会配制硫酸重铬酸钾溶液来浸泡实验用到的容器，先清洗，再浸泡24小时后再用蒸馏水清洗，最后放到250℃烘箱烘干4小时以上，所以小伙伴们要计算好实验时间和容器的使用量，合理安排资源哦。当然，硫酸重铬酸钾溶液配制起来比较危险，是用浓硫酸配的，配制时一定要做好防护措施，注意安全，而且硫酸重铬酸钾溶液对环境也不是很友好，大家可以试着去找一些玻璃器皿的清洁剂，如果有用的好的品牌的话也欢迎推荐给我哟（我是试用过几个牌子的清洁剂，但效果都不是很理想，所以就一直还在用传统的泡酸法）~
最后的最后，再划一遍重点：
1、配标液的时候注意计算称取的量，一般都是很微少的量，用分析天平称量的时候要准确，最好关门关窗，不要有过多的走动，注意不要交叉污染；
2、注意区分样品的基质，选择相应的适合的方法进行检测（建议拒绝油性基质的样品，因为真心提取不出来），注意看不同方法的检出限，如果样品里叶酸含量低于标准检出限，建议退单或者推荐使用非微生物方法进行检测，如果一定要用微生物方法测试，注意规避自己的风险，出具报告时需注明“样品中叶酸含量低于标准检出限，结果仅供参考”等意义相近的术语，减少投诉风险；
3、培养基注意一定要过滤，样液制作过程去也要过滤，过滤是实验成功的一个很重要的步骤，一定不能偷懒哦；
4、菌种培养注意不要让菌长过了，保持最佳活性，才能有好结果；
5、定容的过程中有时用水，有时用含有0.05mol/L抗坏血酸的磷酸缓冲液，实验过程中一定要注意分清楚哦；
6、实验用的玻璃器皿一定要清洗干净，无残留；
7、稀释倍数、计算公式要搞清楚，不要出现计算或换算方面的错误。
本来想把维生素B12和游离生物素也写进来，结果啰啰嗦嗦写了一篇叶酸已经这么多了，害怕大家审美疲劳，那就把这三种维生素的测定分开写吧，也方便大家查看，真是不写不知道，一写吓一跳，原来自己是个话痨体质，好吧，话痨时间有限，文笔也有限，希望大家不要嫌弃，多多关注后续文章，关于叶酸的测定目前我也就想到这么多了，希望能帮到大家，如果有遗漏没有提到的地方欢迎大家查漏补缺，或者大家还有什么疑问可以在评论区提问，有时间的话都会回复大家的啦，至此，本篇完结。
