本文作者：曲连海 董彬 封丽霞 陶文靖 刘赫东
在发达国家以及发展中国家，食源性致病菌引发的疾病已经成为严重威胁公众健康的重要因素[1,2]。金黄色葡萄球菌（StaphylococcusAureus）是引发多种类型感染和食物中毒的病原菌，由此引发的食物中毒发生频率很高[3]。沙门氏菌是最常见的食源性致病菌，也是食源性致病菌中研究最活跃的细菌[4]。沙门氏菌大多数由食物传播，少数可通过水介质传播，可引起多种肠道性疾病及食物中毒[5]，是世界上分布最广泛的致病菌之一。
传统的检测方法检测食品中的致病菌存在周期长、步骤繁琐等缺点，如何快速准确地检测食品中的致病菌已经成为当前的研究热点[6]，快速而准确的检测食源性致病菌的方法变得越来越重要[7,8]。
实时荧光定量PCR融汇了PCR技术的核酸高效扩增、探针技术的高特异性以及荧光技术的高敏感性[9]，在食源性致病菌的检测上已经得到了广泛的应用。
本研究对使用实时定量PCR原理的金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒进行了多方面的评价，为食品安全检测中金黄色葡萄球菌/沙门氏菌的检测提供了一种快速准确的检测手段。
实验材料
样本
奶粉、巴氏奶、纯奶、发酵乳。
菌株
金黄色葡萄球菌阳性菌株：
ATCC27217、ATCC26113、ATCC25923、ATCC29213、ATCC6071、CMCC（B）26003、ATCC6538、ATCC26112、ATCC33591、ATCC43300、FSCC（I）223189等标准菌株及金黄色葡萄球菌分离株共1177株；
金黄色葡萄球菌干扰菌株：
CMCC26069表皮葡萄球菌、ATCC29544阪崎肠杆菌、ATCC25922大肠杆菌、ATCC29212粪肠球菌、ATCC8090弗氏柠檬酸杆菌、CMCC51572福氏志贺氏菌、ATCC10792苏云金芽孢杆菌、CMCC49027变形杆菌、CMCC52202小肠结肠炎耶尔森氏菌、ATCC25922大肠埃希氏菌、ATCC19115单增李斯特菌、CMCC51252痢疾志贺氏菌、CMCC63301蜡样芽胞杆菌、ATCC27853铜绿假单胞菌、ATCC11774枯草芽孢杆菌、ATCC33560空肠弯曲菌、CMCC50333沙门氏菌等非金黄色葡萄球菌标准菌株17株；
沙门氏菌阳性菌株：
CICC21482、CMCC50333、CMCC50220、ATCC14028、CMCC(B)50115、CMCC(B)50071、CMCC(B)50335、CMCC(B)50093、CMCC(B)50094、CICC21480、CICC21488、CICC21489、CICC21497、CICC21498、CICC21586、ATCC7001、ATCC35640、ATCC9842、ATCC13314、ATCC9150、ATCC29934、CMCC50041等标准菌株及沙门氏菌分离株共643株；
沙门氏菌干扰菌株：
CMCC26069表皮葡萄球菌、ATCC29544阪崎肠杆菌、ATCC25922大肠杆菌、ATCC29212粪肠球菌、ATCC8090弗氏柠檬酸杆菌、CMCC51572福氏志贺氏菌、ATCC10792苏云金芽孢杆菌、CMCC49027 变形杆菌、CMCC52202小肠结肠炎耶尔森氏菌、ATCC25922大肠埃希氏菌、ATCC19115单增李斯特菌、CMCC51252痢疾志贺氏菌、CMCC63301蜡样芽胞杆菌、ATCC27853铜绿假单胞菌、ATCC11774枯草芽孢杆菌、ATCC33560空肠弯曲菌、ATCC27217金黄色葡萄球菌等非沙门氏菌标准菌株17株。
主要试剂
金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）LR70501、沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）LR70601。
7.5%NaCl肉汤、BPW、BP平板、血平板、血浆凝固酶试剂、SC、TTB、XLD平板、BS平板、TSI、赖氨酸、NA、靛基质、尿素、氰化钾等培养基。
主要仪器
实时荧光PCR仪：雅睿MA-6000P、伯乐CFX96。恒温培养箱、离心机（2mL）、掌式离心机（0.2mL8联管）、金属浴、涡旋混合器、移液器（10、100、1000μL）及吸头、离心管（2mL）、PCR反应管（0.2mL）等。
实验方法
识别性及特异性检测
用金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）对金黄色葡萄球菌/沙门氏菌阳性菌株（标准株及分离株）及其干扰菌株进行检测并记录检测结果。
灵敏度检测
取金黄色葡萄球菌/沙门氏菌标准菌株增菌液，分别稀释到101、102、103、104CFU/mL，并进行核酸提取及PCR检测，每株标准株每个浓度进行10次实验，10次检测都是阳性的最低浓度即为金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR探针法）对该菌株的检测灵敏度[10]。
取样品（奶粉、巴氏奶、纯牛奶以及发酵乳）25g（mL），加入225mL、7.5%NaCl肉汤/BPW；取金黄色葡萄球菌ATCC27217/沙门氏菌CICC21498标准菌株增菌液添加到稀释好的样品中，使终浓度分别为101、102、103、104CFU/mL，并取1mL进行核酸提取及PCR检测；每种样品每个浓度进行10次实验，10次检测都是阳性的最低浓度即为金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）对样品（奶粉、巴氏奶、纯牛奶以及发酵乳）中金黄色葡萄球菌/沙门氏菌的检测灵敏度。
增菌浓度及验证实验
取样品（阴性发酵乳）25g，加入225mL，7.5%NaCl肉汤/BPW，添加金黄色葡萄球菌ATCC27217/沙门氏菌CICC21498约2CFU，重复30次，37℃增菌18h，对增菌后的样本进行金黄色葡萄球菌/沙门氏菌的计数并按照国标进行进一步的验证，记录阳性样本的金黄色葡萄球菌/沙门氏菌浓度（CFU/mL）。
取30份样品（发酵乳），每份取25g，加入225mL，7.5%NaCl肉汤/BPW；然后再取25g，加入225mL 7.5%NaCl肉汤/BPW，添加金黄色葡萄球菌ATCC27217/沙门氏菌CICC21498约100CFU。37℃增菌18h，从中取1mL进行核酸提取并使用金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒进行检测，其余增菌液按照国标方法继续检测并记录最终检测结果。
结果与分析
识别性和特异性检测
金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒对金黄色葡萄球菌/沙门氏菌阳性菌株及干扰菌的检测结果如表1a/表1b，金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）对金黄色葡萄球菌/沙门氏菌的识别性和特异性均为100%。
表1a金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒识别性和特异性
表1b沙门氏菌核酸检测试剂盒识别性和特异性
灵敏度检测
金黄色萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒对不同的金黄色葡萄球菌/沙门氏菌标准菌株检测灵敏度如表2a/表2b所示，金黄色萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒对金黄色葡萄球菌/沙门氏菌标准菌株的检测灵敏度为100CFU/mL。
表2a金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒检测灵敏度
表2b沙门氏菌核酸检测试剂盒检测灵敏度
金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒对样品中金黄色葡萄球菌/沙门氏菌的检测灵敏度如表3a/表3b所示，金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒对奶粉、巴氏奶、纯牛奶中金黄色葡萄球菌/沙门氏菌的检测灵敏度为100CFU/mL，对发酵乳中金黄色葡萄球菌/沙门氏菌的检测灵敏度为1000CFU/mL。
表3a 金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒对样品中金黄色葡萄球菌的检测灵敏度
表3b沙门氏菌核酸检测试剂盒对样品中沙门氏菌的检测灵敏度
验证结果分析
发酵乳使用7.5%NaCl肉汤/BPW增菌18h后，检测金黄色葡萄球菌/沙门氏菌浓度为105～107CFU/mL（＜10CFU/mL可能是标准菌株没有添加到样品中或者添加到样品中的标准菌株状态不理想而未能成功增菌），如表4a/表4b。
表4a发酵乳7.5%NaCl肉汤增菌18h后金黄色葡萄球菌浓度统计
表4b发酵乳7.5%NaCl肉汤增菌18h后沙门氏菌浓度统计
表 5a金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒识别性和特异性
表5b沙门氏菌核酸检测试剂盒识别性和特异性
结论与展望
结论
金黄色葡萄球菌/沙门氏菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）LR70501/LR70601对金黄色葡萄球菌/沙门氏菌的特异性和灵敏度均为100%，对纯菌的检测灵敏度为100CFU/mL，对奶粉、巴氏奶、纯牛奶中金黄色葡萄球菌/沙门氏菌的检测灵敏度为100CFU/mL，对发酵乳中金黄色葡萄球菌/沙门氏菌的检测灵敏度为1000CFU/mL，在检测发酵乳中的金黄色葡萄球菌/沙门氏菌时，该试剂盒检测与国标法检测符合度没有显着差异。
展望
荧光定量PCR方法灵敏度和准确性高于经典的培养法并且缩短了检测周期，但也必须考虑到食品样品基质的复杂性以及其可能存在的PCR抑制因子，寻找有效的样品前处理方法取出样品中的PCR抑制因子和改善PCR体系以提高整个反应体系的抗干扰能力，是未来提高PCR方法实用性的两个方向。
本文作者曲连海、陶文靖、刘赫东来自北京良润生物科技有限公司；
董彬、封丽霞来自光明乳业股份有限公司。
参考文献
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