当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
在细胞冻存时加入保护剂，能大大提高冻存效果。
常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。（1）、冷冻前一日提前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
（2）、配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为 5-10％，混合 均匀，置于室温下待用。（预先配制冻存液： 含20%血清培养基，10% DMSO加基础培养基 ）
（3）、按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；
（4）、将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；
（5）、向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；
（6）、按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；
（7）、再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。
冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 oC 40 分钟→ -20 oC 30 分钟→ -80 oC 16～18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。
注意点：
（1）细胞在-20度冰箱不能超过1h，以免冰晶过大破坏细胞，可跳过-20直接到-80，这样细胞活率低点。
（2）DMSO稀释时会放出大量热，不可直接加到细胞液中要提前配制。
（3）DMSO必须时细胞培养级别的，新买的本身是无菌的，第一次开瓶后立即少量分装于无菌瓶中，4度保存，避免反复冻容产生有毒物质。
二、细胞复苏（要点动作要快，轻）
（1）、调配370C～400C的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至370C～400C；
（2）、从液氮中取出冻存管，立即投入370C～400C 温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；
（3）、将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；
（4）、将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；
（5）、向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。
注意点：
（1）注意安全，以防冷冻管爆炸，带手套用镊子将冷冻管取出，不可用手。
（2）解冻时，液面不可超过冻存管面，以防污染。
