生长良好的培养细胞
新鲜培养基
DMSO
无菌塑料冷冻保存管
0.4％（w/v）trypan blue
血球计数盘与盖玻片
等速降温机
冷冻保存方法
传统方法
冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
程序降温
利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
保存步骤
（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
（2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。
（3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
注意事项
1
欲冷冻保存的细胞应在生长良好（logphase）且存活率高的状态，约为80–90％致密度。
2
冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
3
注意冷冻保护剂的品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micronFGLPTelflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
4
冷冻保存细胞浓度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma：1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherent tumor lines：5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高的浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。
5
冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞的冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
