最近，实验室收到几份客户委托的粉皮样品，要求对其中的人工合成着色剂进行测定。刚拿到样品就觉得颜色有异样，4份样品中1份颜色还算正常，另外3份颜色较深，呈浅黄色，而且是亮黄的那种。
由于最近实验室检测任务较多，收到样品时并没有立即进行测定，而是将样品保存在了冰柜中，测定前将样品从冰柜中取出并解冻，发现解冻后袋子里的水也呈亮黄色，更增加了对样品质量的怀疑。
2、材料与方法
2.1色谱条件
按照GB/T 5009.35-2003中的液相条件进行测试
色谱柱：CNW Athena C18-WP (250mm×4.6mm ,5μm)
流动相：甲醇：乙酸铵（0.02mol/L）
梯度洗脱：甲醇：20%~35%，3%/min；35%~98%，9%/min；98%继续保持2min
流速：1.0mL/min；柱温：30℃
检测器：测试波长为254nm
2.2 样品前处理
称取约5g粉皮样品于50mL离心管中，加入10mL水，超声提取10min，4000r/min下离心5min，上清液经滤纸过滤至25mL具塞比色管中，重复提取2次，并用少量水清洗滤纸；
将滤液转移至聚酰胺固相萃取柱中，并用少量水洗涤比色管2~3次，洗涤液一并转移至固相萃取柱中，抽滤至近干；
用甲醇-甲酸（V:V=6:4）混合溶液洗涤，再用水洗至中性，抽干后用乙醇-氨水(V:V=7:3)混合溶液解析，直到色素完全解析，收集解析液；60℃砂浴中氮吹至近干，准确加入1mL水，超声溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤后进样分析。
3、结果与讨论
下图为7种人工合成着色剂混合标准工作溶液色谱图以及部分粉皮样品色谱图。
通过比较发现，4份粉皮样品中，3份呈亮黄色的样品在4.8min和5.1min附近出峰，其保留时间与柠檬黄的保留时间4.989min很接近，因此怀疑这3份样品中添加了人工合成着色剂-柠檬黄，而另1份样品中未发现有上述7种人工合成着色剂的痕迹。
由于样品中检出物质的保留时间与混合标准工作溶液中柠檬黄的保留时间略有不同，而且柠檬黄的出峰时间刚好处于样品中两个检出物质出峰时间的中间。
因此需要对这两个色谱峰进行甄别，首先判断这两个是不是柠檬黄的色谱峰，其次判断哪个才是柠檬黄的色谱峰。
如果能解决保留时间漂移问题，使样品与标准工作溶液的保留时间尽量保持一致，也就降低了判断的难度。
高效液相色谱仪分析测试过程中，仪器、色谱柱以及样品基质等都可能是保留时间产生漂移的原因。比较混合标准工作溶液和样品的色谱图可以发现，混合标准工作溶液中成份较多，柠檬黄的峰高较高，而经过前处理后样品成份较为简单，检出物质的峰高较小，因此怀疑两者的样品基质和浓度差异可能是导致保留时间发生漂移的罪魁祸首。
于是单独配制柠檬黄的标准工作溶液，并将其浓度稀释至与样品中出峰物质的峰高相近，同时往样品中加入一定体积的柠檬黄标准工作溶液，进行加标确认，测定结果见下图。
通过上述测试可以发现，柠檬黄标准工作溶液浓度降低之后其保留时间变为4.85min，与样品中其中一个检出物质的保留时间更为接近；样品加标实验表明，加标后4.8min附近的峰高变高，而5.1min附近的峰高几乎不变，因此样品中4.8min附近的色谱峰可能是柠檬黄。
通过加标实验更加深了对粉皮样品中含有柠檬黄的怀疑，但是对于不合格样品的确认还是非常谨慎的，尽量进行多方面求证，防止不必要的麻烦。流动相条件对高效液相色谱的分离行为有很大的影响，改变流动相条件可以改善待测组分的峰形、出峰时间以及与杂质组分的分离度，因此实验中尝试通过改变流动相条件对样品中柠檬黄进一步甄别。
前期的测定结果表明，经过净化后的样品，成份较为简单，杂质峰较少，因此后期实验决定采用等度洗脱的方法进行测定。
与原先的梯度洗脱方法相比，等度洗脱方法有3个好处：（1）缩短样品测定和柱平衡的时间；（2）减少基线的漂移；（3）便于流动相条件的调整。
改变流动相条件后样品和加标样品的测定结果见下图。
随着流动相条件的改变，加标样品并未发生柠檬黄与未知组分之间的分离，同时样品和加标样品色谱峰的保留时间相近，表明样品中检出物质与柠檬黄的性质相近，从而进一步验证了4.8min附近的色谱峰为柠檬黄。
在前期的实验过程中发现，不同检测波长下待测组分的响应者有很大的差别，改变检测波长对上述7种人工合成着色剂的定性和定量有很大的帮助。
采用Waters 2998二级管阵列检测器的3D扫描功能，在波长210~800nm范围内对高浓度的柠檬黄标准工作溶液进行扫描测定，并在柠檬黄出峰位置提取光谱图，可以发现，柠檬黄在258nm和426nm附近均有很强的吸收，见下图。
将检测波长设置为426nm，在等度条件下【甲醇：乙酸铵（0.02mol/L）=20：80】对柠檬黄标准工作溶液、样品及加标样品进行测定，测定结果见下图。
对比色谱图可以发现，改变检测波长后3张色谱图中检出物质的保留时间一致，而且计算其含量，与254nm下测定的结果相近。
经过上述多重验证，基本确定梯度条件下样品中4.8min为柠檬黄的色谱峰，5.1min为杂质的色谱峰。
定性之后还需要定量，由于样品中柠檬黄浓度较低，不在之前配制的标准曲线浓度范围之内，因此重新稀释柠檬黄标准溶液，配制相应浓度的标准工作溶液，并按上述色谱条件进行测定。以样品峰面积Y(mV)对质量浓度X（μg/mL）作图，得到线性回归方程Y=31035X+126，相关系数R2=0.9999
结果表明：在该浓度范围内，方法呈现良好的线性关系。标准曲线见下图。经过计算，3份阳性粉皮样品中柠檬黄的浓度分别为0.32mg/kg；0.30mg/kg；0.051 mg/kg。
4、小结
（1）本实验采用固相萃取-高效液相色谱法测定了粉皮样品中7种人工合成着色剂，并采用多种测试方法对样品中的柠檬黄进行定性和定量分析，提供了几种液相色谱分析中对阳性样品的甄别方法；
（2）柠檬黄是一种很常见的食品添加剂，许多食品中都有添加，主要用于改善食品的色泽，但是GB 2760中粉皮未被纳入柠檬黄允许使用的类别，因此选购食品时千万不要被光鲜的外表迷惑，颜色鲜艳的不一定质量好。
