引 言：随着中国梨果面积及产量的不断增加，梨的深加工 成为采后增值的重要途径之一。梨汁是目前梨果加工的 主要产品之一。在梨汁加工过程中产生大量梨渣，其总 量约为原果质量的 40%～50%。以年产 10 000 t 天然梨汁 工厂为例，其每年扔掉的梨渣达 2 000～3 000 t。梨渣 中存在大量的石细胞，直接用作饲料适口性较差，目前 基本上作为废料丢弃，不仅污染环境，还造成资源浪费。 如果能对梨渣进行开发利用，不仅能够增加企业的经济 效益，还可减少梨渣堆积对环境造成的污染。 多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是芽孢杆 菌科（Bacillaceae）类芽孢杆菌属（Paenibacillus）的革 兰氏阳性细菌，又称多粘芽孢杆菌，对人或动植物没有 致病性。多粘芽孢杆菌是一种植物根际促生细菌，可产 生多肽抗生素、拮抗蛋白、酶、植物激素等多种生理活 性物质，一方面可以用作微生物肥料，促进植物生长、 提高作物产量；另一方面，可以有效防治植物细菌性 和真菌性土传病害，对植物青枯病、番茄枯萎病、油菜腐烂病、黑松根腐病等多种植物病害具有很好的防治效 果，还可防治多种由卵菌、线虫引起的植物病害。因 此，多粘类芽孢杆菌是一类极具开发前景和应用价值的 生防细菌，已被用于生产生物有机肥、微生物肥料和生 物农药。目前市售的该菌剂的剂型主要是细粒剂和可湿 性粉剂。芽孢是产芽孢菌在生长发育后期在细胞内形成 的圆形或椭圆形、厚壁、含水率低、抗逆性强的休眠构 造。芽孢具有耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂等多 种抗逆性，有利于芽孢杆菌在环境中存活、定殖及其菌 剂的加工、运输，是制备微生物菌制剂的理想形式。 液体深层发酵是目前广泛采用的生产芽孢杆菌制剂的方 法。与之相比，固态发酵具有以下优点：培养基来源广 且价格低；使用的设备相对简单，能耗低；产物的产率 较高；发酵过程不排放废水，环境污染较少；生产成本远 低于液体深层发酵。有关多粘芽孢杆菌培养的研究基 本上集中于液态发酵，尚未见到其固态发酵的报道。本 研究以梨渣为主要原料，采用固态发酵方式，研究培养 条件对多粘类芽孢杆菌 D1 生长及产芽孢的影响，以期为 利用梨渣发酵生产多粘类芽孢杆菌菌剂提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 主要原料 新鲜鸭梨渣：由赵县旭海果汁有限公司提供，经测 定，其含水率为 76.2%、残糖质量分数为 5.5%、蛋白质 量分数为 0.32%。 麸皮：藁城永丰面粉厂生产，经测定，其含水率为13.2%、淀粉质量分数为 48.7%、蛋白质量分数为 15.3%。
1.1.2 菌种 多粘类芽孢杆菌（P.polymyxa）D1：由石家庄大众肥 业有限公司农用微生物菌剂研发中心提供。
1.1.3 培养基 斜面培养基：蛋白胨 10.0 g/L，氯化钠 10.0 g/L，酵 母浸粉 5.0 g/L，pH 值 7.0（灭菌前）。 种子培养基：葡萄糖 30.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，酵 母粉 5.0 g/L，KH2PO4 4.5 g/L，CaCO3 2.0 g/L，pH 值 6.7。 梨渣发酵基本培养基：鲜鸭梨渣 50 g、麸皮 20 g。
1.2 主要试验仪器
ZHWY-2102C 恒温培养振荡器（上海智诚分析仪器 制造有限公司）、SPX-250B-Ⅱ生化培养箱（上海贺德实 验设备有限公司）、HW.SY-P1 型电热恒温水浴锅（北京 东方精瑞科技发展有限公司）、SW-CJ-2FD 型超净工作 台（苏州安泰空气技术有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 种子液的制备 将 2～3 环 LB 斜面保藏的多粘类芽孢杆菌 D1 接种 至装有 100 mL 种子培养基的 250 mL 三角瓶中，30℃、 200 r/min 摇床振荡培养 14 h。
1.3.2 多粘类芽孢杆菌 D1 的固态发酵 将鲜梨渣与麸皮以不同质量比进行混合，梨渣、麸 皮比例分别控制为 10∶1、10∶2、10∶4、10∶6，其含水 率分别为，70.47%、65.70%、58.20%、52.57%，以梨渣 和麸皮（加入 38%水）作为对照。分别称取 70 g 上述培 养基放入 500 mL 烧杯中，用 8 层纱布包扎，115℃高压 灭菌 15 min。待冷却至室温（25℃）后，接入 0.1 mL/g 多粘类芽孢杆菌种子液，放入生化培养箱 30℃恒温静置 培养 72 h。发酵期间，每隔 12 h 用无菌玻璃棒搅拌翻料 一次。每组 3 个平行。定时取样，监测菌体生长情况和 观察芽孢形成情况。
1.3.3 培养时间的影响 按 10%接种量，将多粘类芽孢杆菌种子液接入梨 渣发酵基本培养基，30℃恒温静置培养，观察芽孢形成 情况。
1.3.4 外加氮源对产芽孢的影响 向梨渣发酵基本培养基中分别加入尿素 0.7%、硝酸 钠 0.5%、硝酸铵 0.5%、氯化铵 0.5%、豆粕粉 7.0%、脱 酚棉籽蛋白粉 7.0%，以不添加任何氮源的作为对照。接 入 10%种子液后，30℃恒温静置培养 120 h。
1.3.5 添加无机盐的影响 将梨渣发酵基本培养基调整为梨渣 50 g、麸皮 20 g、 豆粕粉 4.9 g。向上述梨渣发酵基本培养基中分别加入氯 化钠 0.5%、碳酸钙 0.5%、硫酸镁 0.5%、磷酸二氢钾 0.5%、 硫酸锰 0.3%、硫酸亚铁 0.1%，以不添加任何无机盐的作 为对照。接入 10%种子液后，30℃恒温静置培养 120 h。
1.3.6 培养温度的影响 梨渣发酵培养基成分调整为梨渣 50 g、麸皮 20 g、 豆粕粉 4.9 g、磷酸二氢钾 0.37 g。接入 10%种子液后， 分别于 25、30、34、37 和 40℃下恒温静置培养 120 h。
1.3.7 装瓶量的影响 梨渣发酵培养基成分为梨渣 50 g、麸皮 20 g、豆粕 粉 4.9 g、磷酸二氢钾 0.37 g。分别称取 30、50、70、90 和 110 g 上述梨渣发酵培养基放入 500 mL 烧杯中，培养 基料层的厚度分别为 1.5、3.0、4.7、5.3 和 6.4 cm，用 8 层纱布包扎，灭菌。接入 10%多粘类芽孢杆菌种子液， 30℃恒温静置培养 120 h。
1.3.8 多粘类芽孢杆菌 D1 最适发酵条件的验证 梨渣发酵培养基成分为梨渣 50 g、麸皮 20 g、豆粕 粉 4.9 g、磷酸二氢钾 0.37 g。称取 70 g 上述梨渣发酵培 养基放入 500 mL 烧杯中，培养基料层的厚度 4.7 cm，用 8 层纱布包扎，灭菌。接入 10%多粘类芽孢杆菌种子液， 34℃恒温静置培养 120 h。
1.3.9 活菌数和芽孢数的计数方法 活菌计数方法：采用平板菌落计数法测定样品中活 菌数（cfu/g，以湿质量计）。芽孢计数方法：将待测 计数样品 80℃水浴加热 15 min，再采用平板菌落计数法 计数，所得计数结果即芽孢数（cfu/g，以湿质量计）。 芽孢率即为芽孢数占活菌数的百分比。
1.4 数据处理方法 每组做 3 个平行，变量以平均值±标准差（x±s）表示， 采用 Spss19.0 软件对每组结果进行 F 检验，检验每组之 间差异显着性。
2 结果与分析
2.1 多粘类芽孢杆菌 D1 的固态发酵 本文采用螺杆式榨汁机生产的鲜鸭梨渣呈松散的豆 腐渣状，适合用作固态发酵培养基。但新鲜梨渣含水率 很高，达 76.2%，可能不利于多粘类芽孢杆菌 D1 的固态 发酵。麸皮是小麦面粉加工的副产物，含水率低，含有 较多的淀粉、蛋白质等营养物质，而且价格低廉。因此， 在多粘类芽孢杆菌 D1 固态发酵时，向鲜梨渣添加了不同 比例的麸皮，其目的是一方面调节梨渣的含水率，另一 方面增加梨渣的营养，其试验结果见图 1。
注：发酵温度 30℃、发酵时间 72 h。不同字母代表组间差异达到显着水平 （P<0.05），下同。 Note: fermentaion temperature 30°C, fermentation time 72 h. Different letters means the significant difference between test groups at 0.05 level, the same below. 图 1 多粘类芽孢杆菌 D1 的固态发酵 Fig.1 Solid-state fermentation of P.polymyxa D1 如图 1 所示，当鲜梨渣（未添加任何辅料）作发酵 培养基时，多粘类芽孢杆菌 D1 菌体生长良好，其活菌数达到 1.6×109 cfu/g，与纯麸皮做培养基时的活菌数非常接 近，这说明梨渣营养较为丰富，是一个良好的培养多粘 类芽孢杆菌培养基。 从图 1 还可看出，随着麸皮添加量（10∶1、10∶2、 10∶4、10∶6）的增加，培养基含水率也随之降低 （70.47%、65.70%、58.20%、52.57%），菌体生长得到显 着改善（P<0.05），活菌数明显增加。造成这种现象的原 因可能是，麸皮的添加不但降低了培养基的含水率，增 加了氧气供给，而且改善了培养基的营养。当梨渣与麸 皮的比例为 10∶4 时，活菌数达到最高值 2.5×109 cfu/g。 当麸皮添加量继续增加时，活菌数不再增加，因此，梨 渣与麸皮的适宜质量比为 10∶4。在 72 h 发酵期间，观 察了芽孢的形成情况，发现均没有芽孢形成。由于芽孢 的形成非常有利于微生物菌剂的生产、储运及使用，芽 孢率是微生物菌剂质量的重要指标，因此，如何使得多 粘类芽孢杆菌 D1 产生大量芽孢就成为后续研究的重点。
2.2 发酵条件对多粘类芽孢杆菌 D1 产芽孢的影响
2.2.1 培养时间的影响 培养时间是影响芽孢杆菌形成芽孢的重要因素之 一。从图 2 可以看出，随着培养时间的延长，活菌数在 逐渐增加，当培养至 120 h 时达到最大值。
注：培养基：梨渣 50 g、麸皮 20 g；发酵温度 30℃。 Note: cultural medium: pear residue 50 g, wheat bran 20 g; fermentation temperature 30°C. 图 2 培养时间对多粘类芽孢杆菌 D1 产芽孢的影响 Fig.2 Effect of cultivation time on sporulation of P.polymyxa D1 在培养前 72 h，并没有观察到有芽孢形成；当培养 至 96 h 时，才有部分菌体形成芽孢，芽孢率仅为 23.8%。 96 h 以后，随着培养时间的延长，芽孢形成量快速增加， 120 h 时芽孢数达到最大值。然后，随着培养时间的延长， 芽孢数不再增加。因此，多粘类芽孢杆菌 D1 的较适培养 时间为 120 h。周荣华等[14]研究了多粘类芽孢杆的液态发 酵工艺，发现多粘类芽孢杆 NR1 培养 40 h 时，就能大量 形成芽孢；而在本研究中，多粘类芽孢杆菌 D1 芽孢的形 成很缓慢，这可能与固态培养及菌种有关。在生产实践 中，培养时间的延长意味着生产效率的降低和染菌的机 会的增加。因此，如何缩短多粘类芽孢杆在梨渣发酵培 养基上的形成时间尚有待进一步研究。
2.2.2 外加氮源的影响 本文使用的鲜鸭梨渣含蛋白率仅为 0.32%，而微生物 生长需要充足的氮源，所以在发酵时应补充必要的氮源， 从而使微生物得到充分的生长。此外，生产成本也是需 考虑的重要因素，因此，向梨渣发酵基本培养基中，添 加了 2 种廉价的有机氮源（豆粕粉、脱酚棉籽蛋白粉） 和 4 种无机氮源（尿素、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵）， 试验结果见图 3。从图 3 可以发现，外加氮源对多粘类芽 孢杆菌 D1 活菌数和芽孢数均影响很大。在所试验的 6 种 氮源中，与未添加氮源的对照相比，添加尿素、硝酸钠 和豆饼粉使得菌体生长明显改善，活菌数和芽孢数均显 着增加（P<0.05），其中添加豆饼粉的效果较好，其芽孢 数和芽孢率分别达到 2.61×109 cfu/g 和 88.2%；而添加硝 酸铵、氯化铵和脱酚棉籽蛋白粉却对菌体生长和芽孢形 成较大有抑制作用。硝酸铵和氯化铵的抑制作用可能是 由于二者均为生理酸性物质。从图 2 还可以看出，添加 硝酸钠时的芽孢数略低于添加豆饼粉，因此，从生产成 本的角度考虑，在实际生产时可选择添加硝酸钠。
注：培养基：梨渣 50 g、麸皮 20 g；发酵温度 30℃；发酵 120 h。对照：不 添加任何氮源的梨渣发酵培养基。 Note: cultural medium: pear residue 50 g, wheat bran 20 g; fermentation temperature 30°C, fermentation time 120 h. Control: cultural medium of pear residues without any added nitrogen source. 图 3 氮源对多粘类芽孢杆菌 D1 产芽孢的影响 Fig.3 Effect of nitrogen source on sporulation of P.polymyxa D1
2.2.3 无机盐对产芽孢的影响 芽孢并不是细菌生活史中不可缺少的部分，只是产 芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆性休眠体，它的 形成受很多因素的影响，其中培养基中无机盐的种类及 含量是关键因素。从图 4 中可以发现，添加无机盐对菌 体生长和芽孢形成影响较大。与未添加无机盐的梨渣发 酵培养基（对照）相比，添加氯化钠、碳酸钙、硫酸镁、 磷酸二氢钾和硫酸锰时均可促进菌体生长，使得活菌数 明显提高（P<0.05），尤其是磷酸二氢钾，使得活菌数增 加了 65.4%，达到了 4.73×109 cfu/g；而添加硫酸亚铁却抑 制了菌体的生长。陈小煌等[17]也发现氯化钠、硫酸镁和 氯化钙能促进多粘类芽孢杆菌 B-306 生长，而硫酸亚铁 有抑制生长作用。然而，无机盐对芽孢形成的影响却不 同于对菌体生长的影响。当添加氯化钠、硫酸镁、碳酸 钙和硫酸亚铁时，多粘类芽孢杆菌 D1 形成芽孢受到了严重抑制，芽孢率大大降低。仅有硫酸锰和磷酸二氢钾可 促进芽孢的形成，特别是磷酸二氢钾，使得芽孢数达到 了 4.52×109 cfu/g，比对照增加了 2.99×109 cfu/g，其芽孢 率达到了 95.6%。关于无机盐对芽孢杆菌形成芽孢的影 响，多数研究表明，钙盐、锰盐和钾盐可促进枯草芽孢 杆菌形成芽孢。但本研究发现，添加碳酸钙却抑制 多粘类芽孢杆菌形成芽孢，这可能是由于菌种及培养条 件不同。根据上述结果，尽管梨渣中含有一定量各类无 机盐，但其种类及含量不能满足获得最大芽孢数的要求， 仍需人为补充无机盐，特别是需补充磷酸二氢钾。
注：培养基：梨渣 50 g、麸皮 20 g、豆粕粉 4.9 g；发酵温度 30℃；发酵 120 h。对照：不添加任何无机盐的梨渣发酵培养基。 Note: cultural medium: pear residue 50 g, wheat bran 20 g, soybean meal 4.9 g; fermentation temperature 30°C, fermentation time 120 h. Control: cultural medium of pear residues without any added mineral salts.
图 4 无机盐对多粘类芽孢杆菌 D1 产芽孢的影响 Fig.4 Effect of mineral salts on sporulation of P.polymyxa D1
2.2.4 培养温度的影响 培养温度是影响多粘类芽孢杆菌生长的重要因素之 一。如图 5 所示，在 25～34°C 范围内，随着培养温度的 升高，活菌数和芽孢数均随之增加。当培养温度为 34°C 时，活菌数和芽孢数达到最大值，分别为 5.04×109 cfu/g 和 4.53×109 cfu/g。当培养温度超过 34°C 时，随着温度的 升高，活菌数显着降低（P<0.05），而芽孢数则急剧下降 （P<0.05），这说明高温严重抑制多粘类芽孢杆菌 D1 形 成芽孢。据报道，在液态发酵条件下，多粘类芽孢杆菌 的最适培养温度为 28～30°C[17,21]，而在本研究中，多粘 类芽孢杆菌 D1 的较适培养温度却为 34°C，这既可能与 菌株的不同有关，也可能与固态发酵方式有关。
2.2.5 装瓶量的影响 多粘芽孢杆菌一个极度高耗氧微生物，溶氧对其生 长及芽孢形成影响非常大[22]。在固态发酵中，培养基装 瓶量的高低则直接影响氧气的供给。从图 6 中可以发现， 随着培养基装瓶量的增加（30、50、70、90、110 g）， 料层厚度加大（1.5、3.0、4.7、5.3、6.4 cm），氧气供给 的逐渐减少，使得活菌数和芽孢数均显着下降（P<0.05）， 尤其是芽孢数的降低幅度更大。根据此结果，在实际的 固态发酵生产中，要特别注意影响氧气供给的工艺参数， 如培养基的厚度、翻料次数和通风量，否则，就会严重 影响多粘芽孢杆菌的芽孢数及芽孢率，使得产量降低。
注：培养基：梨渣 50 g、麸皮 20 g、豆粕粉 4.9 g、磷酸二氢钾 0.37 g；发酵 120 h。 Note: cultural medium: pear residue 50 g, wheat bran 20 g, soybean meal 4.9 g, KH2PO4 0.37 g; fermentation time 120 h.
图 5 培养温度对多粘类芽孢杆菌 D1 产芽孢的影响 Fig.5 Effect of cultivation temperature on sporulation of P.polymyxa D1
注：培养基：梨渣 50 g、麸皮 20 g、豆粕粉 4.9 g、磷酸二氢钾 0.37 g；发酵 温度 30℃；发酵 120 h。 Note: cultural medium: pear residue 50 g, wheat bran 20 g, soybean meal 4.9 g, KH2PO4 0.37 g; fermentation temperature 30°C, fermentation time 120 h.
图 6 装瓶量对多粘类芽孢杆菌 D1 产芽孢的影响 Fig.6 Effect of medium volume on sporulation of P.polymyxa D1
2.2.6 最适发酵条件的验证
根据单因素的试验结果，多粘类芽孢杆菌 D1 固态发 酵的最适培养基为梨渣 50 g、麸皮 20 g、豆粕粉 4.9 g、 磷酸二氢钾 0.37 g，较适培养条件为：培养基料层厚度 4.7 cm、接种量 10%、培养温度 34℃、培养时间 120 h。 采用上述的较适发酵条件进行了多粘类芽孢杆菌 D1 的 固态发酵（验证试验）。发酵结束后，经过测定，多粘 类芽孢杆菌 D1 的活菌数和芽孢数分别为 5.09×109 cfu/g 和 4.78×109 cfu/g，芽孢率为 93.9%。
3 结 论
以新鲜鸭梨渣为主要原料，采用固态发酵方式，研究了培养条件对多粘类芽孢杆菌 D1 生长及产芽孢的影 响，结论如下：
1）梨渣含有较多的残糖，且呈松散的豆腐渣状，是 一个良好的固态发酵原料，适合培养多粘类芽孢杆菌。 添加麸皮可调节梨渣的含水率。当梨渣与麸皮的质量比 5∶2 时，获得最大活细胞数，2.5×109 cfu/g。
2）向梨渣发酵培养基中，添加尿素、硝酸钠和豆饼 粉可明显提高活菌数和芽孢数（P<0.05），其中添加豆饼 粉的效果较好。培养基中添加质量分数为 0.5%磷酸二氢 钾极大地促进了菌体生长和芽孢的形成。随着培养基装 瓶量的增加，芽孢数也随之明显减少。多粘类芽孢杆菌 D1 的较适培养温度为 34°C，较适培养时间为 120 h。
3）适宜培养条件下的活菌数、芽孢数和芽孢率分别 为 5.09×109 cfu/g、4.78×109 cfu/g 和 93.9%。
