获得成功分离的另一个重要因素就是流动相有机溶剂的选择，如果使用反相色谱柱可以有三种有机溶剂可以选择，甲醇、乙腈和四氢呋喃。每一种溶剂都有其独特的优点，但色谱分析人员很少能预见哪一种溶剂更合适，所以具体选择哪一种溶剂你必须充分考虑同行的意见。
在我的实验室中多数工作分析药物中的成份，其中有些样品的紫外吸收很弱，所以分析时紫外检测器的波长为220nm 甚至更低，但是四氢呋喃的紫外吸收比较强，所以在波长低于240nm 时，就不能选择这种溶剂。尽管低浓度的甲醇在较低的波长下也可使用，但是在低于220nm 时，甲醇的浓度不易控制。选择何种溶剂还必须考虑其与样品及空气之间不发生作用，而四氢呋喃易分解，形成过氧化物，所以使用这种溶剂时须格外小心。一些研究人员发现，在四氢呋喃中加入水可以解决这个问题，但它与色谱柱平衡所需的时间比甲醇、乙腈长，而且其不愉快的气味也是一个不利因素。与四氢呋喃相比，甲醇和乙腈的最大优点是在柱压较低的条件下，流速可控制在1-2ml/min之间。
考虑到理想溶剂的特点，如粘度低、紫外吸收弱、与样品不相互作用，而且使用方便，所以首选的有机溶剂应是乙腈，当然利用甲醇作为有机溶剂的也较为常见。
水相的选择
假如样品为一般化合物，可以用水作为水相，然而离子化合物在药物分析时普遍存在，而这类化合物需要控制PH 值才能得到很好的分离。如流动相的PH 值必须高于或低于样品的PKA1.5个单位。在分析有机酸时，当PH 值低于3时，色谱柱一般还比较稳定，然而当PH 值高于8时，就需要缓冲液，因为此PH 值已经超出了二氧化硅的有效使用范围。宽PH 值的二氧化硅柱也比较常见，但是对高PH 值物质的分离，很少有这方面的报道。所以建议使用缓冲液来减少二氧化硅的流失。
考虑到样品的特性及柱子的稳定，建议在分析PH 值较高的物质时应使用缓冲液，2.5mM 的磷酸盐缓冲液 (PH=2.5)是非常合适的水相。如果在分析方法中使用了分光仪，那么就必须选择易挥发的缓冲液，尽管不如真正的缓冲液有用，但0.1% Trifluoroacetic酸和乙酸能够满足PH 值的控制要求。
