由于引物设计方法局限和多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）体系间干扰等因素，现有文献报道能同时检测的成分数多为5 个及以下且检出限较高。来自中国肉类食品综合研究中心的周彤、李家鹏、李金春等人，应用引物的简并性设计，即寻找遗传相近的物种（鸡鸭、狗狐貉、山羊、绵羊等）通用而与其他物种特异的DNA序列来设计引物，实现不增加聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）反应重数的前提下，提高可检测物种的种类，开发一种基于5重RT-PCR熔解曲线分析的肉及肉制品中猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉9 种源性成分的同步鉴别方法，为相关部门提供可靠的技术手段和执法依据，具有巨大的市场需求和广阔的应用前景。
结果与分析
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引物特异性检验
分别使用猪、牛、羊、鸡鸭、狗狐貉及5 对特异性引物的混合体系对提取好的猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、鹿、鱼、狐狸、貉子、马、猫、驴、鼠15 个物种DNA（稀释到相同质量浓度5 ng/μL）进行RT-PCR检测。5 对引物均表现出了良好的特异性，只对测试引物相对应的物种产生阳性特异性扩增，而对其他物种在30 个循环内无典型扩增曲线出现。5 对引物混合后对各物种DNA的多重PCR检测扩增曲线结果与单一引物检测相同，这为开发完整的基于多重RT-PCR熔解曲线分析的掺假检测技提供理论依据。
不同物种组合的样品（混合样品中各肉种成分比例相同），采用5重RT-PCR体系对各样品进行检测和熔解曲线分析，进一步验证方法体系的特异性，同时确定各物种成分特异性熔解峰的Tm值范围。所有样品出现熔解峰的位置均与样品已知肉种组成相符，未出现非特异性扩增，表明方法具有较好的特异性，多重RT-PCR熔解曲线图谱中各源性成分Tm值的分布范围分别为：绵羊源性成分Tm值（71.8±0.6）℃，山羊源性成分Tm值（73.3±0.4）℃，牛源性成分Tm值（74.7±0.7）℃，狗、狐狸、貉源性成分Tm值（77.2±0.9）℃，猪源性成分Tm值（80.8±0.5）℃，鸡源性成分Tm值（85.1±0.4）℃，鸭源性成分Tm值（87.4±0.2）℃。
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方法的灵敏度检验结果
将10、1、0.1、0.01、0.001 ng猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐狸、貉子9 个肉种DNA样品及猪、牛、绵羊、鸭、狐狸混合DNA样品，进行5重RT-PCR及熔解曲线分析，检测本方法灵敏度。采用本方法体系检测多物种混合DNA，猪、牛、羊、狐狸、鸭5 种源性成分的检出限均为0.1 ng。
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市售肉类样品检测
为了进一步考察本方法的准确性和实际应用性，对100 份随机采集的市售肉类样品进行检测，结果表明，Tm值在（71.8±0.6）℃范围内出现熔解峰（绵羊源性成分）的有18 份样品；Tm值在（73.3±0.4）℃范围内出现熔解峰（山羊源性成分）的有3 份样品；Tm值在（74.7±0.7）℃范围内出现熔解峰（牛源性成分）的有50 份样品；Tm值在（80.8±0.5）℃范围内出现熔解峰（猪源性成分）的有28 份样品；Tm值在（85.1±0.4）℃范围内出现熔解峰（鸡源性成分）的有10 份样品；Tm值在（87.4±0.2）℃范围内出现熔解峰（鸭源性成分）的有10 份样品。
生肉片肉卷、酱卤肉制品、肉串、干制品、香肠和火腿制品等各类肉制品中均存在掺假情况，掺假率达27.0%，其中肉串类食品掺假最为严重，掺假率高达40.7 %，大多采用鸡、鸭等低价肉种替代或掺假。上述结果表明，该方法可以用于实际样品（包括生鲜样品和熟肉样品）掺假的快速鉴别。
结 论
本研究建立的一种基于5重RT-PCR熔解曲线分析的肉及肉制品掺假鉴别方法，可以准确的同时检测肉及肉制品中猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉9 种源性成分。该方法具有良好的特异性及灵敏度，可用于实际样品（包括生鲜样品和熟肉样品）掺假鉴别，大幅降低了检测成本，提高了检测效率和准确率，对加强肉类市场监管、有效抵御肉制品掺假，保护消费者和相关肉制品企业利益是十分重要的，为相关部门提供可靠的技术手段和执法依据，具有巨大市场需求和广阔的应用前景。
