介绍
临床生物标志物已经存在了很长一段时间，而且这个领域正在迅速发展。除了遗传和蛋白质标记外，我们现在还有microRNA、表观遗传标记、脂类、代谢产物和成像标记物。有些是非常有用的（伴侣）诊断；其他可能只是一个指标。然而，也存在一些问题。在命名和生物标志物如何被验证和使用的方式上存在混淆。在2006出版的建议是为了在物质创造一定的清晰度和一致性。目前最大的障碍是生物标志物的验证和鉴定依赖于不同地点（不同实验室）的确认。不同研究中所用的生物材料的制备存在一致性，需要时抗体的一致性。还应该指出，在定量免疫组织化学（IHC）需要一个量化标准的方法。最近的观点揭示了另一层复杂性：统计分析是容易产生错误的结论下在软件编码错误。它可能不是那么一个另一个导致的观察，只有约11%的临床前研究论文显示重复的结果的一个惊喜。现在是评估生物标志物验证和资格认证过程中不同程度干扰的时候了。
生物材料
组织标本的完整性将决定生物标志物测量的质量，特别是当生物标志物不稳定时。特别是验尸样品不代表样本的个人生活因为验尸延迟。由于验尸延迟将因人而异，衰变的水平将大大改变每个样品。因此，宰后样品最适合定性分析。在验尸中任何生物标志物定量的解释应额外care5。
血浆样品可以用不同的方式：他们可以制备柠檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA）或肝素。此外，可以在血清和全血中检测生物标志物。很明显，生物标志物的水平将需要相比同样处理的样品之间为了避免变化的噪声从不同样品prepared6。由于这个原理是普遍的，所以对于任何其他组织类型都是适用的。
显微镜检查，组织玻片和细胞悬液必须按照所需的检测方法才能进行调查。固定剂（醇、醛），包埋材料（石蜡、LR白色，等）和温度（冷冻和加热）对组织和细胞的完整性有深刻的影响，他们将决定成功的检测。再次，在组织制备的一致性，组织切片和细胞分析是paramount7,8。当数据以不同的方式处理时，数据分析可能会出现偏差。
记录和保存生物系统的方法已被提出，旨在成为新的标准：生物改进研究质量报告（brisq）改善的一致性提供了一种工具和规范对生物samples9信息。
抗体的选择
质谱和RT-PCR定量检测材料的一致性是强大的。然而，免疫检测的稳健性很大程度上取决于检测中使用的抗体的选择。一旦抗体在一种检测中得到成功验证，这种检测就被这种抗体所定义。改变的抗体可能会改变结果完全是在past10,11证明。当抗体需要改变时，检测不再被验证，验证过程必须用新的抗体重复。出于这个原因，偏爱使用单克隆抗体。这背后的理由是，偏好的抗体克隆数会定义其特点：期望是检测仍将验证因为抗体保持相同的时候，使用相同的克隆数的抗体，不管他们是来自哪个供应商。不幸的是，这是一个神话。根据供应商（有时取决于目录编号），所有具有相同克隆数的制剂都会有所不同：抗体可从腹水中从培养基中纯化，或完全不经纯化（只需腹水或只培养上清液）。这些不同的配方会对抗体需要稀释，以避免非特异性background12方式的影响。因此，单克隆抗体需要重新验证在相同的测定在原配方不再可用。但即使是来自同一配方的后续批次也显示出一定程度的差异，从而破坏了在标准分析中使用单克隆抗体的主要论点。一种肽产生的多克隆抗体，从一个更大的动物比兔（大批量）可以作为一个符合成本效益的替代方案，因为批这种抗体批量变化是由免疫肽与其他多克隆antibodies12尺寸限制。
法的发展
当一种新的检测方法正在研制中时，单克隆抗体可能并不总能获得。然后，肽产生的多克隆抗体可以作为一个好的和成本效益的替代品。然而，当一个来自不同动物的新批出来时，多肽多克隆抗体需要一轮新的验证，就像不同的单克隆抗体一样。
在检测过程中，稀释抗体以避免非特异性背景是必要的，但它必须足够强大，以便能够测量动态范围，特别是在定量分析的情况下。当检测依赖于二次抗体，这种抗体需要验证（有或没有主），以便评估其非特异性信号（噪声）12。
特异性需要通过比较不同数量的感兴趣的蛋白质（分析物）的样品加标和未加标来解决。信号需要与加标数量成比例。此外，标本称没有任何分析物需要标本称在自然levels13有物的比较。
检测和截止值
敏感性通常归因于检测中使用的抗体，但这是一种误解。灵敏度是由抗体/ /或一级抗体和二级抗体参与的检测方法决定的。如果分析物的含量低，则需要较高的灵敏度。这种增强的敏感性通常不能通过增加抗体浓度来实现，虽然使用亲和力较高的抗体在某种程度上会有所帮助。但在一般的检测方法的变化（荧光、同位素、PCR等）是采取适当步骤。随着灵敏度的增加，噪声和背景也会增加。当改变到一个更高的灵敏度要求，验证应集中于更严格的制度让噪声和背景在bay12。
当量化是一个要求时，需要将截断值放在适当的位置。无论是最低水平的量化（LLOQ）和量化的最高水平（hloq）必须确定。通常检测限也是确定的，但这只适用于定性工作。在免疫组织化学中，这些值变得棘手，因为信号的强度不仅仅是由检测器产生的数目，信号的密度与组织中的位置相结合。此外，量化的表面积需要定义良好的边界。即使这些措施都到位，其组织和幻灯片的质量可能危及这些措施和歪斜的results14。因此，在所有实验室的一个特定的测试一致性（相同的稀释度、相同的组织样本、相同面积的表面、相同的染色分析等）并没有遵循世界上所有的实验室时，免疫组化诊断容易引起误解。
统计数据和结论
众所周知，统计分析提供了作者所需的便利证据。不管使用什么统计方法，当从较大的集合中选择输入数据时，默认情况下任何结果都会有偏差和有缺陷。只有对所有数据的分析（非选择）才会产生适当的结果，但它们可能是不确定的或不方便的。发表在同行评审的论文作者在力最不可理解的方式呈现统计的压力，知道他们的同事会不承认自己的混乱和可能把作者的话它。即使统计结果是正确的，他们也可能会被误解。因此，最初的主张是基于偏见和薄弱的统计数字，只有随着时间的推移，当有更多的科学细节可用时，一个更复杂的图景才会出现。比如胆固醇水平与心血管疾病的disease16,17，癌症并非仅因mutations18,19，肥胖如何不选择lifestyle20,21等简化的说法可以（已经）被明显的利益冲突的驱动在study22建议。由于缺乏科学的完整性，生物标记物的声誉受到了极大的损害，因此许多科学家对生物标志物数据库的用处失去了信心。新准则引入了出版商为了介绍如何统计presented23新标准。
市场上有几个统计软件供科学家和临床医生使用。然而，这些包都是比较先进的，需要专业的处理，很像一个驾照是为了安全地使用机动车辆在公共道路。此类软件的供应商承认他们的产品并非总是正确使用（个人通信）。所选的算法需要适合于要分析的数据类型：一些算法是为决策而设计的，它们不一定适用于科学事实发现。此外，同一系统中输入的同一数据可能会在不同的场合产生不同的输出，这是因为要求进行错误类型的结果（与统计分析师的个人通信）。最后，微妙的编码错误的软件总是不能确定小测试脚本的完整性，只有倾斜的结果时，大数据正在3.。
项目设计和个性化医疗/分层方法
当以上所有的障碍都成功地解决了，我们还不太清楚。每个人都不同于下一个人，因此每个人对毒素和药物有不同的耐受性或敏感性。这使得生物标志物的评估跟踪疾病的进展，或遵循一个治疗的疗效，难以分析当一组患者治疗后都以同样的方式，但在群体的个体在遗传和/或种族背景，数据仍然可以在所有地方都是如此多样化。只有当一个集团是由一定的遗传或环境背景的定义，会有足够的变化来评估这个特殊定义的一组生物标志物。例如，最近才发现HER2型乳癌患者不受益于治疗，当他们把pick3ca突变相比，那些not24。它像鸡蛋（自相矛盾）范式：一开始临床试验，以确定无反应的患者，只有一个可以让他们进行一种新的生物标志物的验证。然而，正确的验证需要正面和负面的控制，而不允许只选择方便的数据。虽然这一矛盾可以得到妥善处理，但在今后某一时期寻找合适的临床生物标记物仍然是非常具有挑战性的。
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