大肠杆菌无细胞表达系统目前最为常见的是E.coliS30提取物表达系统。E.coliS30提取物系统(E.coliS30ExtractSystems)是利用ompT胞内蛋白酶和lon蛋白酶活性缺失突变体菌株E.coliB制备而来，通过添加氨基酸、T7RNA聚合酶和能量物质等来实现目的蛋白的表达。
大肠杆菌无细胞表达系统制备目的蛋白基本原理如下：
1、质粒DNA或是直接的PCR产物，在RNA聚合酶的作用下在体外合成mRNA；
2、利用细胞抽提物中的转录因子、各类合成蛋白质所需的酶和外加补充的氨基酸、能源物质、tRNA等将mRNA翻译成蛋白质；
3、转译后释放的mRNA再循环利用无细胞系统合成蛋白质，重复数次后mRNA失活。
大肠杆菌无细胞表达系统制备目的蛋白的流程大致如下：
1、E.coliB菌液制备，生长对数期收集菌体；
2、大肠杆菌细胞破碎（超声波、玻璃珠研磨、低温高压等），制备E.coliS30提取物系统；
3、加入氨基酸、T7RNA聚合酶和能量物质等构成反应体系；
4、表达质粒的加入，孵育，检测；
5、目的蛋白纯化。
大肠杆菌无细胞表达系统相比于大肠杆菌表达系统，具有更多的优势：
1、可以直接利用PCR的基因片段作为模板表达目的蛋白，省略载体构建、转染、阳性克隆筛选、表达等大量的步骤，节省大量时间；
2、可以直接实现多个蛋白在同一体系中同时表达，直接用于蛋白互作验证实验；
3、通过96T板等，可以实现多个蛋白的同时表达，完成蛋白的快速筛选；
4、实现标记蛋白的制备，以及特殊氨基酸的引入；
5、实现跨膜蛋白的表达，解决部分蛋白原核表达为包涵体的难题；
6、可以直接干预蛋白的表达，实现蛋白表达的人为操控。
