注意
电压:进入分离胶之前30V,之后100 V,在跑至分离胶底部之前可以调至200V.注意温度不能超过35~40℃.
2.本实验适合小蛋白、多肽的分离.1~100kD.
3. Spacer gel 10%gel的用途是为了使1~5 kD的小分子得到更好的分离.是否配制,按照自己需要.
一.试剂及缓冲液
AB-3 浓缩胶 : 9.6g丙烯酰胺 0.3g甲叉双丙烯酰胺 溶于20ml水.(49.5%T,3%Cmixture)
AB-6 分离胶 : 9.3g丙烯酰胺 0.6g甲叉双丙烯酰胺 溶于20ml水. (49.5%T,6%Cmixture)
凝胶缓冲液: 1X 2.422gTris 0.02gSDS溶于20ml水,HCL调节pH=8.45.
样品缓冲液:1X 12%SDS,6%mercaptoethanol,30%glycerol,0.05%coomassie blue G-250,150mMTris\HCL(pH=7.0)
阴极缓冲液: 1X 1.0MTris 1.0MTricine 1%SDS pH约8.25,基本不用调.
阳极缓冲液: 1X 1.0MTris 0.225MHCL pH=8.9, HCL调节.
固定液: 250ml甲醇,50ml冰醋酸, 0.05mol醋酸铵 加水定容500ml.( 0.7mm,30min)
染色液: 0.025%考马斯亮蓝G-250 10%冰醋酸. ( 0.7mm,60min)
脱色液: 10%冰醋酸. ( 0.7mm,2h或者过夜)
二.配胶: 0.07×14×14cm 两块胶的用量.
(一) Separating gel 16%gel
1. AB-6: 5ml
2.凝胶缓冲液: 5ml
3.Glycerol: 1.5g
4.上述加水至15ml
5.10%APS 50ul
6.TEMED 5ul
(二)Spacer gel 10%gel
1. AB-3: 600ul
2.凝胶缓冲液:1ml
3.Glycerol: 0.3g
4.上述加水至3ml
5.10%APS 15ul
6.TEMED 1.5ul
(三)Stacking gel 4%gel
1. AB-3: 500 ul
2.凝胶缓冲液: 1.5ml
3.上述加水至6ml
4.10%APS 45ul
5.TEMED 4.5ul
