通过测定总氮含量而计算得到的蛋白质含量称为粗蛋白(crude protein, CP) ,目前国家标准方法中测定的即为粗蛋白含量。乳中的氮含量包括蛋白态氮(proteinnitrogen, PN)和非蛋白态氮( non protein nitrogen, NPN) ,其中前者占95% ,后者约占5%。蛋白质是乳中的主要含氮物质,含量约2.8% ～3.8%。乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白及少量脂肪球膜蛋白。乳清蛋白中有对热不稳定的乳白蛋白和乳球蛋白,上述蛋白构成了乳中的“真蛋白”[1]。
蛋白质是牛奶的主要成分，且牛奶中的蛋白质是完全的蛋白质，由于含有人体必需的氨基酸，所以营养价值很高，牛奶中的蛋白质消化率可以达到90%～100%[2]。乳中其他含氮物主要来源于乳中的氨、尿素、肌酸、肌酸酐、尿酸、乳清酸、多肽、马尿酸、氨基酸和其他成分,这些成分构成了非蛋白质氮。
真蛋白( true protein, TP)即真正的蛋白质,在测定方面可定义为除了非蛋白质氮以外的蛋白态氮所计算得到的蛋白,正常情况下,天然乳中真蛋白的含量少于粗蛋白。酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白质,主要以胶束状态存在于乳中,它是以含磷蛋白质为主体的几种蛋白质的复合体,主要分为αs12酪蛋白、αs22酪蛋白、β2酪蛋白和κ2酪蛋白4种。一般情况下,乳品真蛋白中约有80%为酪蛋白,但其含量因个体差异、牧场管理、乳牛品种的不同而变化[1]。
2.乳及乳制品中真蛋白测定的研究背景
牛奶及乳制品中含有丰富的蛋白质，但在牛奶收购、生产环节中，质量掺假事件时有发生，尤以“劣质假奶粉”事件和“三聚氰胺奶粉”事件为甚。目前，乳制品的消费量很大，根据FAO统计，世界人均年消费乳制品46kg，是日常饮食结构的重要组成部分，它的安全性直接影响到人们的身体健康，所以一旦出现质量或安全问题，它暴露的受害人群和风险就会高一些。尤其牛奶对婴幼儿有代母乳的作用，在婴儿成长的特定阶段，成为其全部营养来源，因而，乳制品的安全至关重要，世界各国都对乳制品的质量控制制定了相当严密的标准体系[2]。
目前检测蛋白质的国家标准方法是凯氏定氮法，其结果只是氮的质量分数， 而不是真正意义上的蛋白质质量分数。这种缺陷造成某些不法分子对牛奶进行掺假，添加硫酸铵、三聚氰胺、水解植物或动物蛋白等含氮物质。要杜绝这类问题，必须建立真蛋白质的检测方法[3]。
3.乳品中真蛋白的测定方法：
3.1 电位滴定法
2009年唐伟英等人[4]为排除牛乳中三聚氰胺等非蛋白氮的干扰，探索研究了电位滴定法测定牛乳中真蛋白的含量。它的基本原理为：蛋白质的两端有游离的具有酸性的羧基（－COOH）和碱性的氨基（－NH2）， 当加入甲醛溶液时， 氨基上的两个氢原子被次甲基所取代， 于是便失去了氨基的碱性特性， 从而使其呈酸性的羧基释放出来，使溶液的电化学特性发生变化。再用氢氧化钠标准溶液滴定游离的羧基（－COOH）， 从而用经验公式计算其蛋白质含量。
与凯式定氮法相比，该法可以排除三聚氰胺、尿素对牛乳中蛋白质测定的干扰，其次该方法所需检测仪器及试剂常规，操作简便，而且大大缩短了测定时间，提高了工作效率，具有一定的推广使用价值。但从其原理中不难得出此法不能排除铵态氮（氯化铵、硫酸铵、碳酸铵等）的干扰，有一定的局限性。针对这一漏洞唐英伟等人在2009年提出了改进方法即：在测定前在试样中加入浓碱液加热检查有无氨气放出， 验证有无铵态氮。若有， 则先将铵态氮分离出去，再用电位滴定法测定； 若没有，则可直接用电位滴定法测定。
3.2 三氯乙酸-双缩脲比色法
该方法的基本原理为：采用150 g/L 的三氯乙酸溶液(在混合物中的最终浓度约为120 g/L )沉淀乳中的蛋白质,用过滤法分离沉淀和溶液,沉淀部分含蛋白态氮,非沉淀部分(溶液)含非蛋白态氮。将滤渣收集起来,再用双缩脲法进行定氮。即可得出样品中的真蛋白含量。2011年侯彩云等[5]人利用该方法提出了真蛋白率这一概念。并测定了添加过乳清蛋白乳粉的蛋白质量分数。结果表明，乳清蛋白的加标回收率在89.2%~99%之间，重现性在0.26%~0.98%之间，表明三氯乙酸-双缩脲比色法可以较好地检测出乳中的真蛋白。
该方法是对凯式定氮法的改进，在样品检测前先将其中的蛋白质沉淀，可以很好的排除三聚氰胺、尿素等非蛋白氮的干扰。后期采用双缩脲法对滤渣进行蛋白质含量测定，且操作简便迅速，可提高工作效率，但灵敏度比较低,测定范围为1～20 mg 蛋白质,适用于精度要求不高的蛋白质含量测定。
3.3 紫外分光光度法
紫外分光光度法的基本原理[6]为：蛋白质中含带共轭双键的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,其吸收峰在280 nm 处,吸光度与蛋白质含量成线性关系,因此,通过测蛋白质溶液的吸光度,即可测得样品中蛋白质的含量。2010年陈静[7]等人采用紫外分光光度计，在280 nm波长处，通过吸光度值来测定真蛋白质量浓度；采用FT-120、甲醛滴定法、凯氏定氮法进行对比验证；考察人为添加非蛋白类含氮物质氯化铵、硫酸铵、尿素对真蛋白含量检测结果的影响。测得蛋白质量浓度的回收率在94.0%~106.7%之间，通过精密度实验，得到相对标准偏差为2.06%。结果表明，紫外分光光度法检测真蛋白质量浓度与其他3种检测方法差异不显着；且检测结果不受人为添加非蛋白类含氮物质的影响。
紫外分光光度法检测生鲜牛乳真蛋白质量浓度，方法快速、可行，非蛋白态氮不能计入蛋白质质量浓度，可以有效防止不法分子以含氮有机物冒充蛋白质的违法行径。
3.4 考马斯亮蓝G-250法
考马斯亮蓝法是由考马斯亮蓝G - 250 染料与蛋白质通过范德华引力结合,使蛋白质染色,通过比色测定蛋白质含量的方法。2007年南亚[8]等人研究了最佳实验条件, 成功地建立一个牛乳中蛋白质快速测定的方法, 具有简单、快捷、易行等特点。结果表明该方法精密度高, RSD 为1.70%, 结果准确, 相对误差较小, 回收率98.2%~100.3%。
考马斯亮蓝G- 250 与蛋白质结合的反应十分迅速且稳定,这一方法具有灵敏度高、干扰物质少、测定快速、简便等优点,不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响,适合大量样品的测定，可推广到其他乳制品及保健食品、植物蛋白饮料等中的蛋白质测定。但由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差[9]。
3.5 凝胶柱层析——考马斯亮蓝染色法
考马斯亮蓝染色测定蛋白质是一种经典的方法，但按传统方法配成的显色剂却存在着溶解不完全、比色池上极易沉积等问题，实际操作时对测定的准确性干扰较大。为此2010年张弘[3]等人对考马斯亮蓝显色剂中进行了改良，加入了大分子的醇类和酚类物质，新研制的显色剂溶液溶解度好，比色池上沉积很少，且稳定，存放一年不影响测定。此外还研发出了牛奶蛋白质快速检测仪，该仪器体积小、操作简便、检测速度快、灵敏度高，且能有效消除添加的三聚氰胺、尿素、硫酸铵等无机氮，及水解植物和动物蛋白等小分子多肽氮对牛奶中蛋白质检测的干扰，从而能从根本上杜绝牛奶中掺假蛋白检测题，可用于现场牛奶真蛋白质快速检测。结果表明，牛奶中蛋白质分子量绝大部分集中分布在1×104~ 7×104 u以上和1×104 u以下分子量的蛋白质所占的比例很小。综合应用牛奶中蛋白质的分子量分布特征和考马斯亮蓝染色法的特性研发出。
该法通过对考马斯亮蓝进行改良，基于马斯亮蓝染色法的特性和牛奶中蛋白质分子量的分布特征研制出牛奶蛋白质快速检测仪。分子量约1 ku以上含氮物中的肽链和考马斯亮蓝结合，在波长595 nm处达到最大吸收值。牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白和清蛋白两大类，它们的分子量大多在1×104 ~3×104 u；蛋白质分离检测仪检测的结果表明：牛奶中的蛋白质分子量集中分布在1×104 ~7×104 u，和考马斯亮蓝的显色作用非常明显，因此灵敏度很高。牛奶中的其他物质，如脂肪、多糖、维生素等均不与考马斯亮蓝作用，掺假物质，如三聚氰胺、尿素和硫酸铵等基本也不显色，因此能有效识别；而水解植物和动物蛋白中，大部分是小分子肽，只有很少一部分的大分子蛋白质才能显色，但如果要达到和牛奶相同的显色值，含氮量要达到牛奶的20倍左右才能做到，因此，用牛奶蛋白质快速检测仪测定蛋白质，可有效地防止牛奶中掺假蛋白质的干扰，从而能从根本上杜绝牛奶中掺假蛋白的检测问题，可用于现场牛奶真蛋白质的快速检测[3]。
3.6 毛细管电泳法
电泳是指在电场作用下,带电粒子向着与其所带电荷电性相反的电极移动的现象。电泳法,就是指带电荷的供试品(如蛋白质、核苷酸等) 在惰性支持介质(如滤纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等) 中,在电场的作用下,向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动,由于各组分之间的移动速度不同,使各组分分离成狭窄的区带,并用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法[6]。
毛细管电泳法也称高效毛细管电泳法,它是近十几年发展起来的一项新的分析方法,结合了电泳和色谱两大技术。Miralles等人[10]用CE法对乳中变性的β2乳球蛋白和对位2κ2酪蛋白进行了分离和定量测定,并研究了pH值、尿素浓度、柠檬酸浓度、电压等因素对试验结果的影响,结果表明该法可在30 min完成乳制品中变性β2乳球蛋白和对位2κ2酪蛋白的定量检测。但是由于该法使用的仪器昂贵、操作较为复杂,在一定程度上限制了它的应用范围[11]。
3.7 红外光谱分析法
近红外光谱是介于可见光(VIS) 和中红外光(MIR 或IR) 之间的电磁波, 美国材料检测协会(ASTM) 将近红外光谱区定义为波长780 ～2 526 nm的光谱区[12]。通过分子振动、转动的状态变化在不同能级间产生跃迁,当其能量与近红外光谱区内某一波长处光子的能量相当时,可产生近红外光谱吸收。食品中蛋白质和多肽在这个波段的特征吸收可以用来测定蛋白质的含量[6]。
近红外光谱技术的主要特点有:分析速度快、分析效率高、适用的样品范围广,对样品无损伤等。已广泛应用于谷物、乳类、肉类、烘焙类、豆类蛋白质的分析测定中,但仪器价格昂贵,灵敏度相对较低[6]。
3.8 数字图像法
该方法是基于双缩脲反应原理, 通过一次性采集标样和试样乳粉处理液的图像信息,得出试样乳粉的蛋白质含量。
王旭等[13]人利用凯氏定氮法和数字图像法测定添加了不同NPN的乳粉蛋白质含量, 分析非蛋白态氮对凯氏定氮法和数字图像法测定乳粉蛋白质含量的影响。结果表明，对于没有人为添加非蛋白态氮的乳粉来说, 用凯氏定氮法和数字图像法测定结果具有较好的一致性。当乳粉中含有大量NPN时, 凯氏定氮法测得的粗蛋白含量无法体现蛋白质的真实情况。一旦乳粉中恶意添加大量非蛋白态氮,采用数字图像法测定蛋白质含量, 其结果不受干扰。数字图像法大体上可以看作针对真蛋白质特有的反应, 非蛋白态含氮物质对测定结果没有影响, 测定乳粉中的真蛋白含量具有较高的准确性。
3.9 直读法
蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀(precipitation),变性蛋白质一般易于沉淀,但也可不变性而使蛋白质沉淀。引起蛋白质沉淀的主要方法有盐析、重金属盐沉淀、生物碱试剂以及某些酸类沉淀、有机溶剂沉淀、加热凝固等。吴敏[14]等人通过对生鲜牛乳进行脱脂和水浴加热后, 加入蛋白质沉淀剂、离心分离得到蛋白质沉淀, 直接根据沉淀体积读取出牛乳中蛋白质含量。结果表明，在置信度大于90%时,置信区间为(8.72±0.43), RSD 为4.75%, 此方法作为一种快速测量牛乳中蛋白质的方法, 可广泛用于各个奶站和奶厂收奶, 也可用于质检部门进行快速检测, 结果快速, 比较准确, 费时较短且成本低廉,不失为一种优良的快速检测方法。
3.10 Udy染料染色法
Udy染料染色法采用蛋白与一定pH的橙酸12染料结合的原理测定乳中的氨基酸,如精氮酸、组氨酸和赖氨酸,其中蛋白质的多肽长度须在5个氨基酸以上。其红色的色泽随蛋白的含量增加,即结合的越多而减退,即色泽的强弱与蛋白的浓度呈反比,因此只要在一定的波长下测定其色泽的程度,即可计算得到真蛋白的浓度[15,16]。用Udy染色法测定牛奶样品中的真蛋白含量只需不到1 min的时间, 1967年,该法得到AOAC认可[17]。
4 结论
由于中国国家标准中乳品蛋白质检测方法的缺陷,出现掺加尿素、铵肥甚至三聚氰胺等氮含量高的有机物来提高“蛋白质含量”的违法操作,严重制约了我国乳制品的质量提升,影响了消费者的身体健康。近几年来，关于乳品中真蛋白的检测方法的研究也比较多，其中不乏有许多操作简便、对设备要求不高、检测时间短，灵敏度较高的方法，如直读法、数字图像法、紫外分光光度法、三氯乙酸——双缩脲法等。这些方法的研究对规范我国乳品中关于真蛋白的检测具有推动作用，为进一步提升乳品质量做出了贡献。
