传统上, ESCs和iPSCs等干细胞都是在有血清和饲养层(feeder layer)的条件下贴壁扩增进行传代培养的, 即采用标准的2D(two-dimensional)培养模式。这类方法需要分离饲养层, 有病原体污染的危险, 且不易操作, 培养出的干细胞容易发生变异, 细胞产量也受到一定的限制。而生物反应器的提出在一定程度上解决了这些问题。
生物反应器的发展
至今, 已经发展出了多种类型的生物反应器。
(1) 滚瓶式生物反应器(roller bottles bioreactor): 此种方法利用转瓶培养器在不断摇动的细胞培养箱中进行细胞培养。此种方法操作最简单, 转瓶培养器具有使用方便、价格低廉等特点。但此种培养体系只适合于贴壁依赖型细胞的培养。培养过程中可实时监控各种理化参数(pH、O2等)的变化, 但不够直观, 而且pH改变造成的浓度梯度对培养环境仍有很大的影响。
(2) 搅动悬浮培养生物反应器(stirred suspension bioreactor, SSB): 此种体系设计是最经典、最早被采用的一种生物反应器, 通常由罐体、管路、阀门、泵和马达等组成, 由马达带动桨叶混合培养液, 通过搅拌器的作用使细胞和养分在培养液中均匀分布, 罐体上安装的不同传感器在线持续检测培养液的pH、温度、溶氧等参数。此法操作也较简单, 既适用于以细胞团块或单细胞形式进行的悬浮细胞培养, 也适合贴壁型细胞的微载体培养。相比于滚瓶式生物反应器, SSB培养过程中的各种理化参数的变化可以得到更好的监控。但是搅动会对细胞造成一定的损伤, 死细胞比较多, 另外也会存在微载体黏连细胞或细胞聚团的现象发生。
(3) 摇袋式生物反应器(wave bioreactor): 此种体系是由美国研发的一种专利产品。装置中, 细胞及培养液被置于一个预先消过毒的无菌一次性塑料袋中, 通入由除菌过滤器过滤的空气后会形成具有一定空间的培养容器, 袋子被置于一个摇动的平台上, 随着摇动平台的左右摇动, 培养基液体在袋子中形成波浪式的运动, 起到良好的混合作用。此种方法通过一次性耗材进行细胞培养, 使污染的可能性降到最低, 更符合标准化操作的要求, 但是操作中细胞的放取及监控细胞培养状态等具有不简便性, 同时成本花费比较大。
(4) 旋转壁式生物反应器(rotating wall vessel, RWV): 此种体系与SSB体系工作原理及装置大致相同, 只是此种方法不是利用搅动来混合细胞和营养物质, 而是利用旋转来混合。相比于SSB系统, 对细胞造成的损伤比较小, 并且能更好地进行气体交换。但此系统需要复杂的设备, 且不易进行可量化使用。
(5) 平板型生物反应器(parallel plates bioreactor, PPB): 此系统通常由多层平板、中空支架和外壳三部分组成。平板与平板之间隔开固定于中空支架上, 中空支架是直径为1 cm的空心圆柱体, 上端开口、下端封闭。每层平板上都有一层纤维支架, 作为细胞附着的载体。在柱体上侧还开有四条纵长的侧孔, 这些侧孔被层层支架分割成一个个小孔分布于每两层支架之间, 这些小孔的作用是用于细胞的培养和培养液的循环。此种体系可实现细胞的大规模培养, 其培养过程中细胞新陈代谢产生的副产物可以随时去除, 使其有毒代谢物含量比较低, 但是同时细胞培养中产生的分泌性因子也随之减少, 对细胞培养也有一定的害处。
(6)固定流化床式生物反应器(fixed and fluidized bed bioreactor): 通过3D(three-dimensional)支架来为细胞的贴壁和生长提供依附, 细胞被固定在多孔的载体上, 载体固定在中空管中, 培养基在管内流动。在固定床中, 培养基在载体间流通, 在流化床中载体在培养基的上升流作用下流动, 培养基在床体间流动, 随着流动, 床体高度增加。在此种体系中细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用能更好地模仿生物体内的复杂结构, 更有助于细胞的生长。但相比于其他生物反应器, 不能进行大规模的扩增细胞。各种不同生物反应器的主要特征介绍如表1所示。
早期的生物反应器研究侧重于细胞扩增, 近年来研究则侧重于3D培养环境对细胞的表面标志物、细胞的增殖能力、分化能力等的影响。选择合适的 3D培养方法, 能够为细胞创造良好的环境, 用以保持培养过程中干细胞的特性。优化反应条件, 包括建立最佳培养环境, 改良生物反应器结构, 实现个体化干细胞生产流程。所以各种生物反应器将在干细胞体外培养扩增、定向分化和组织工程中有极大的实际应用潜能。
