在GB／T 15000．2-1994《标准样品工作导则(2)标准样品常用术语及定义》中对标准样品的定义如下：标准样品是具有一种或多种足够均匀的和很好确定了的特性值的材料或物质，可以用来校准仪器、评价测量方法和给材料赋值。标准样品的研制涉及我国各个领域，从过去传统的环境、冶金、有色发展到建材、农业、临床化学、生物、医药等等，随着动物检疫及分子生物学方向的发展，动物检疫分子标准样品是21世纪刚刚兴起的一门学科。目前国外已经建立了比较完善的标准样品研制技术体系．包含检测信息收集、调研、技术研究、方法验证、标准制定、实验室水平测试等方面。国际上也已经有部分质粒标准样品，但未见动物检疫类标准样品，尤其是动物检疫RNA类标准样品。
动物病毒按照遗传物质可以分为DNA病毒和RNA病毒两大类，其遗传物质单股(single mand)或双股(double strand)、核酸相对分子质量、RNA为正义(sense)或反义(anti-sense)都是主要的分类依据。本章主要针对动物检疫RNA标准样品的研制进行论述。
病毒全RNA标准样品的研制内容主要包括病毒的分离与纯化。病毒的增殖．病毒的特性．一级结构获得．均匀性、稳定性分析和定值。
一、病毒的分离与纯化
通过各种生物学、化学、物理等方法将病毒分离纯化，主要方法如下：
(一)生物学方法
1、病毒蚀斑法(viru。plaque formatlon)：D．ulbecco于1952年将噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术成为测定病毒感染力和研究的主要方法之一。其原理是用高度稀释的病毒液感染玻璃瓶、平皿或平板中培养的单层细胞。病毒对宿主细胞有致病变的作用．其利用宿主细胞的原材料来繁殖病毒．由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边临近的细胞扩展。病毒经过几个增殖周期，宿主细胞不能复制，逐渐形成一个局限性病变细胞区．形成病毒蚀斑。从理论上讲．一个病毒粒子只形成一个蚀斑．因此，根据蚀斑的大小、形状和色泽等性状，选择不同的代表进行移植传代，就有可能获得若干不同的纯系毒株(包括变异株)。但在实际上，一个蚀斑往往由成千上百个病毒粒子形成。因此．接种的病毒液要充分分散和稀释，反复多次进行蚀斑分离．才有可能获得来自一个病毒粒子的“纯系”病毒。否则由一个蚀斑分离获得的毒株是许多个病毒的后代，常会影响滴定的准确性和克隆的纯一性，最终导致试验的失败。固体介质的浓度取决于病毒的大小，颗粒较大的病毒用浓度较低的介质．颗粒较小的病毒用浓度较高的介质．这样蚀斑的生长速度会控制在适宜的范围内。小蚀斑需用光学显微镜观察．1 mm～10 mm的大蚀斑可用肉眼计数。为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每mL蚀斑形成单位(PFU／mL)来表示。病毒原液的滴度PFU/mL一(平均蚀斑0接种量)×病毒的稀释度。
2、病斑分离法：有些病毒可以在鸡胚绒毛尿囊膜上增殖．例如痘病毒和某些疱疹病毒等，可以根据其在绒毛尿囊膜上形成的病斑特征进行纯系分离．其原理和方法同蚀斑分离法基本相同。
3、鸡胚终点稀释法：该法最初应用于研究甲型流感病毒所谓的O—D变异时创立的：终点稀释法目前已经广泛用于毒株纯化和变异株选育等工作，特别是在那些不能进行蚀斑分离或病斑分离的病毒。假如许多禽流感、新城疫病毒变异株的纯化。如果想纯化原毒株，将原毒高倍稀释，如10-8～10-5．每个稀释度接种3～5管细胞培养物。根据细胞病变出现情况．选定“终点”管。如在10-8稀释度接种的5个管中有3管出现细胞病变．则这3管就是终点：可以有条件地认为它们是一个或少数几个病毒粒子的后代。鉴定并选出其中最具原病毒株特性的一株，并视需要将其再作2～3轮终点稀释．通常即可获得纯系毒株。如分离纯化变异型病毒“B”．应首先将原毒进行低倍稀释(100倍或1000倍)，多次传代．使变异株病毒的数量相对增多．然后再用上述终点稀释分离方法。为提高分离率．可以应用终点或接近终点的多管细胞培养物，从中选取较多呈现变异型毒株特性的管，再作以后几轮的终点稀释分离。直至获得纯系变异毒株。
4、细胞克隆法：在细胞培养瓶内先培养病毒敏感的细胞系．待其长成单层后．接种高度稀释的原始毒种。37℃温育lh后，应用细胞分散剂．例如胰酶、二乙胺四乙酸二钠(EDTA)或链霉蛋白酶(pronase)等将单层细胞从玻璃表面消化成单个细胞。将此消化的细胞悬液用营养液再次高度稀释．使每毫升营养液内约含1个细胞。随后接种大量的小培养瓶或小培养管，每瓶(管)1 mL。再置37℃温度下培养，约经2d～3d，选择确含1个细胞的培养瓶(管)．即为初步纯化的病毒。再经几次同样的接种和筛选，就可获得纯化的毒株。应用微量培养板进行细胞克隆，方便更为简单。
