2、一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。
3、实验设计时所釆用的抗原批次要一样，尽量的避免人为的带来个体差异。特别在做裂解液时更要注意所釆用的操作条件，尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。
4、凝胶的质量直接影响以后的实验结果要特别注意几点，凝胶要均一没有气泡，积层胶与分离胶界面要水平，AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂，拔梳子时要快尽量保证点样孔平整。
5、电泳、转膜时特别要注意正负极电压电流都不能过高转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气泡，尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。
6、封闭时一般在室温下2h就够了，但是要注意如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。
7、加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景，还要注意一抗二抗的匹配。
8、在显色发光时要特别注意二抗所对应的显色方法特别是在发光时要注意发光时间和显影时间的控制以看得清楚目的条带为标准。
