比利时根特大学（Ghent University）的Frank Vanhaecke教授及其团队这几年来一直在开发一种可以取代放射性标记法的技术，他也因此成为2017年Lester W. Strock奖的获得者，今年10月SciX大会将为Frank教授颁发该奖项。
本文截取自Spectroscopy对Frank教授的专访，今天我们就来领略一下没有放射性标记技术的定量药物代谢分析到底神奇在哪里。
在药物研发中，您已经开发出一种全新的定量分析方法对人血浆中的代谢物进行分析，首先，我们想知道为什么需要新的方法呢？
我们在这个研究领域已经闯荡的很多年，几年前，一家药物研发公司主动与我们联系。这家公司之前已经研发出一款针对肺结核的药物。药物的整个研发过程及其复杂，包括ADME研究，在这个过程中，大部分的精力都用在了新开发的活性药物成分（API)）的吸收、分布、代谢和排泄表征。
对于所形成的代谢物的鉴定，肯定少不了高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术（HPLC–ESI-MS）的存在，但是对于代谢物的定量分析，这种仪器联用技术通常无法满足要求，因为其敏感度往往要依靠于分子结构，一种标准无法应对药物的每一种代谢物。
因此，为了实现药物代谢物定量分析目的，一种携带放射性标签（14C或 3H）的药物分子出现了。使用这种放射性标记版本的药物，可以直接对所有代谢物进行定量研究，因为使用了带有放射检测技术的HPLC具有很强的敏感性，而且不依靠分子结构就可以做出反应。
但是这种治疗肺结核的药物在临床实验中会在人体的肺部停留很长时间，因此，若是使用带有这种传统的带有放射性标物的药物进行人体内部研究的话，势必会对志愿者造成一定的伤害。
因此这家制药公司就联系了我们，想要设计一种“冷”研究法（不使用放射性示踪剂）。他们提出的要求在我们的研究组内展开了热烈的讨论。由于API含有Br原子，所以我们开发了一种基于高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（1）的分析技术。
后来我们发现这种方法不仅可以用在这家公司研制的治疗肺结核的药物上，因为活性药物成分的放射性标记版的合成具有相当大的挑战，而且很烧钱，也浪费时间。更重要的是，让受试志愿者服用放射性化合物的做法本身也违反伦理道德，况且样本与废弃物的处理也是个问题。
那您为何觉得HPLC–ICP-MS技术适合解决这个问题呢？
像放射检测一样，ICP-MS不需要依靠分子结构就可以在核素监测的条件下做出仪器响应。因此，每一种代谢物的定量分析工作不会要求每一种代谢物必须有相应的标准可以参考。除此之外，ICP-MS本身具有很强的敏感性，而且是一种专门针对元素分析的技术。
听说您曾优化了Cl、Br和I的ICP-MS检测。在优化的这一步当中，您曾经遇到了哪些困难？
我们首先处理了含有能被ICP-MS测量到的元素的药物。他们是卤素、氯元素、溴元素和碘元素。所有的这些元素都在最佳电离效率下被定性。对于氯元素而言，电离效率估算值小于1%。更不堪的是有些元素还会出现谱峰重叠。
为了解决色谱干扰问题，我们一般会使用化学拆分法。我们深深地被ICP串联质谱的性能所深深吸引。在这个设备中，碰撞反应细胞位于两个四级杆滤质器中。双质量选择可以很好的控制碰撞反应细胞的反应过程。
我们经常使用在目标离子与反应气体分子之间的选择性相互作用下形成的反应产物离子。这些反应产物离子可以在另外一个质荷比的免干扰条件下测得，该质荷比由串联设备中的第一组四级杆产生。
当HPLC分离（如平成所需的那样）使用梯度洗脱时，定量的准确性也是一个棘手的问题。流动相的持续变化也会让一起的敏感性不断变化。在我们第一个应用当中（溴元素检测），使用在线非特异性同位素稀释法可以规避该问题。
但是，像磷和碘这样的目标元素为单一同位素，而其他的元素，像硫元素或者氯元素，想寻找它们的核素并不可行，它们的信号可以无干扰监测。因此我们研究了其他方法，比如反梯度法或者开发一种数学描述函数来描述流动相成分的功能敏感性变化情况。至少对于氯元素而言，我们看到这种数学函数可以在一组流动注射测量（2）的基础上导出来。
如果药物当中所含的元素无法使用ICP-MS监测到的话，你会通过衍生倒入这样一种元素。您是如何选择衍生化试剂的？
在选择合适的衍生化试剂时，有很多因素需要考虑。当然，先决条件就是我们需要向API中引入一种元素，目的是让ICP-MS可以“发现所有元素”。 衍生试剂处理API的某一反应基团及其代谢物，而且反应效率应该是（接近）100%。
我们推崇在充分温和条件下（我们认为80℃的反应温度，在1小时内完全转化应该是更好的条件）使用一步衍生化方法。所选用的试剂应该是常见的，并且价格低廉。之后我们在文献中寻找合适的衍生化试剂，并通过实验的方法筛选具有理想效果的那些试剂，来评估它们是否适合我们的目的。
衍生过程遇到了哪些困难？
反应副产物的形成是一件讨厌的事。比如说含有四溴邻苯二甲酸酐化合物的氨基的衍生，我们将4-二甲氨基吡啶（DMAP）作为催化剂加速反应，但是由于目标分析物中存在酚羟基，因此这种方法会导致二次衍生的发生（单个代谢物的多个衍生物或反应产物）。
还有溶解度的问题也需要解决。比如说，在上面提到的研究当中，虽然乙腈被认为是最好的反应溶剂，但目标分析物（左旋甲状腺素及其代谢产物）无法被乙腈溶解。最后，稳定性也需要考虑，因为有时候分析物具有热不稳定性。在同一个研究当中，左旋甲状腺素在高于40℃的时候会产生降解产物。
另外，内源性化合物也可能成为衍生物。因此，色谱分离方法不仅不会成功分离API及其代谢物，也不会从衍生的内源性化合物或天然含有的元素引入的API及其代谢物内源性化合物中分离出API。
您所采用的方法至今为止发现了什么结果？
首先让我们高兴的是我们为含溴抗结核药物的定量代谢分析成功地用在了人类志愿者（耐多药肺结核患者）的体内研究环境中。同时，这个药物市场上已经在销售，就我们所了解，美国食品与药品管理局首次批准了这种使用HPLC–ICP-MS技术进行代谢物定量分析的药物。从那之后，我们接二连三的克服了不断发生的分析难题。
每一次我都看到了我的小伙伴儿们不仅成功的开发出应对这些难题的方法，还遇见了一些奇思妙想，让我们的方法可以适用于更广泛的领域，不仅提高了我们的价值，还让这种方法更加简单。
我们最近的研究发现，对于含有氯元素的化合物而言，在描述氯离子的灵敏度随流动相组成的变化而变化的数学函数基础上，直接的定量分析是切实可行的。
我们也验证了含有伯胺的药物（及其代谢物）可以被成功衍生，这样一来Br活I原子的ICP-MS监测可以实现HPLC–ICP-MS的定量代谢分析。
参考资料
B. Meermann, M. Bockx, A. Laenen, C. Van Looveren, F. Cuyckens, and F. Vanhaecke, Anal. Bioanal. Chem. 402, 439–448 (2012). DOI: 10.1007/s00216-011-5339-y.
B. Klencsár, L. Balcaen, F. Cuyckens, F. Lynen and F. Vanhaecke,Anal. Chim. Acta 974, 43–53 (2017). DOI: 10.1016/j.aca.2017.04.030.
