目前，大多数啤酒腐败菌检测方法的最主要问题是费时。为了缩短检测时间，国内外啤酒科技工作者开发出包括聚合酶链反应（PCR）在内的多种啤酒腐败菌检测技术。但常规的PCR技术由于无法区分样品中的死菌与活菌，往往会导致检测结果出现较高的假阳性。前人研究发现，在样品PCR扩增前加入叠氮溴乙锭（EMA）处理，可分区分活细胞和死细胞，从而更好地解决这个问题。
一般情况下，作为主要啤酒腐败菌的短乳杆菌能够耐受啤酒中的酒花化合物，从而容易引起啤酒的腐败。通常认为，啤酒腐败短乳杆菌耐受酒花的机制为多因素调控过程，涉及了细胞代谢和形态变化，同时还涉及多药转运机制和酒花外排机制。在啤酒腐败短乳杆菌中分布最广泛的耐酒花基因为horC。另外一个被发现的酒花耐受基因是bsrA，该基因最近被发现于可污染啤酒的有害片球菌中。来自中国海洋大学食品科学与工程学院、啤酒生物发酵工程国家重点实验室、华南理工大学食品科学与工程学院的马艳琳、徐振波、刘君彦等人，以horC为靶基因进行EMA-PCR扩增，研究该方法区分啤酒腐败短乳杆菌活和热致死细胞的可行性。
结果与分析
不抑制活细胞DNA扩增的最大EMA质量浓度的确定
当EMA质量浓度高于20 μg/mL（P＜0.01）时，活细胞DNA扩增开始减少。自20μg/mL质量浓度开始继续增加EMA的质量浓度时，活细胞DNA的扩增效果逐渐降低。当EMA质量浓度为100 μg/mL，DNA的扩增完全受到抑制。
抑制热致死细胞DNA扩增的EMA最小质量浓度的确定
抑制热致死细胞DNA扩增的EMA最低质量浓度为1.0 μg/mL，远低于抑制活细胞的DNA扩增质量浓度（＞20 μg/mL）。为了保证抑制效果，在后续实验中选取3.0 μg/mL作为EMA的使用质量浓度。
活菌和热致死菌的EMA最适光照时间的确定
对于活细胞DNA的选择性扩增的光照时间选择1 min或者更长时间。后续试验选择10 min作为光照时间，以确保EMA能够结合于DNA进而引起细胞裂解，并完全抑制热致死细胞中DNA的扩增。
EMA-PCR扩增灵敏度的测定
针对horC基因的EMA-PCR扩增的灵敏度是通过测定所需最小短乳杆菌活菌数来确定的。从图4可知，建立的EMA-PCR方法对短乳杆菌的检测限为10CFU/PCR体系，即104 CFU/mL样品，因为每个PCR反应中只需要1 μL样品）。
不同比例活和死细胞混合样品的EMA-PCR扩增差异
不同比例热致死细胞和活性细胞混合物中总细胞均控制在1×105个/mL，如预期所示，死细胞中靶向DNA的扩增抑制的有效的EMA质量浓度为3.0μg/mL。即使在热致死细胞占总细胞数的99.9%时，DNA扩增条带的荧光也未受显着影响（此时相对荧光强度约为3900，而死细胞比率为50%时相对荧光强度为5500）。这一现象与啤酒生长实验结果相一致。在检测这8株啤酒腐败短乳杆菌horC基因时， EMA-PCR显示出很高的特异性。
分析与讨论
本研究发现，使用到的全部啤酒腐败乳酸菌菌株的horC基因PCR扩增反应均为阳性，由此可以更加确定horC基因具有定性啤酒腐败乳酸菌的作用。因此，可以把horC作为预测目标菌啤酒腐败能力的有效靶基因，有必要进一步的研究horC特异性EMA-PCR扩增方法对其他啤酒腐败菌适用性，使其更好地应用于检测啤酒腐败微生物。
在对啤酒样品进行PCR扩增检测前，应用EMA进行前处理可有效减少死细胞的假阳性，该方法在工厂实际应用上具有很大的潜力。应用基于horC基因的PCR特异性扩增方法可有效检测具有污染啤酒能力的乳酸菌，为啤酒厂在产品质量控制方面做出快速和准确的判断提供依据。
