1、水性病原体是导致世界范围内的人和动物疾病和死亡的主要原因；
2、饮用水、娱乐用水和环境水的常规微生物检测是保护公众健康的基本措施；
3、水中微生物检测是基于粪便污染的指标的检测，而不是特定的病原体的检测；
4、水体微生物检测大多数常规实验室方法都是基于膜过滤；
5、利用分子生物学技术可对水体微生物进行快速检测。
根据世卫组织（WHO）的统计，每年大约有340万人死于水污染导致的疾病，其中大多数为儿童。此外，在发展中国家，大约有50%的人口正在承受水体污染导致的疾病，正是基于如此严峻的形势，各国政府和救援组织都把确保用水安全提到很高的级别。研究表明人或动物的粪便是水性感染的主要来源，而防止污水和农业废水进入供水系统是保证饮用水安全的关键。
先进的国家或城市，一般饮用水系统有完备的基础设施和治理体系所保证，因此总体上是安全有保障的。但要长期持续的保持一个安全的水供应则需要一套完备的监控方法，且需要持续的关注和定期检测。
目前我所在水工业体系中已经开发了一系列高效的方法来检测饮用水系统中是否存在粪便和微生物的污染。这些方法不局限于对饮用水的检测，也可应用到生活和环境的水域，或是易受人类活动导致污染的水体中。
水体污染微生物
在受污染的水中存在多种类的病原微生物，其中重要的水生病原体如下：
细菌：气单胞菌属（Aeromonas spp）、弯曲杆菌（Campylobacter spp）、梭状芽孢杆菌（Clostridium spp），大肠杆菌（包括VTEC类型，例如O157）、军团菌（Legionellaspp.）、钩端螺旋体菌（Leptospira spp.）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、沙门氏菌（Salmonella enterica）、志贺氏菌（Shigella spp.）、弧菌（Vibrio spp）和耶尔森氏菌（Yersinia spp.）。
病毒：腺病毒（Adenoviruses）、甲型肝炎（Hepatitis A）、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）、诺如病毒（Noroviruses）、轮状病毒（Rotaviruses）。
原生动物：隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）和贾第虫属（Giardia spp.）。
污染的水中会存在大量病原微生物，想要对这些病原体完成全部检测是不现实的，首先若对水样进行如此大的综合性检测需要大量的实验操作和昂贵的成本；其次即使在被严重污染的水中，这些病原体往往也只有很少的量，这也进一步加大了检测的难度。
为了解决上述在检测中存在的问题，我们研究发现，由于人或动物的粪便是水体感染的主要来源，而受污染水中的大多数（虽然不是所有的物种）病原体即由此渠道携带而来，因此检测时我们可以通过“指示”细菌的存在来判断水系统是否受粪便污染。
指示生物
指示生物是在人类和动物粪便中存在的高数量级的细菌，同时也存在于污染水中。理想状态下，它们不应该再有其他来源，也不应该能在供应水或水生环境中繁殖，同时又十分便于从从水样中分离获得。遗憾的是并没有一个生物体可以完全符合所有上述要求，只有大肠杆菌最接近这个标准，因而它被选为理想的指示种。
大肠菌群的其他成员，如克雷伯菌属、肠杆菌属也可作为检测粪便污染的指标，但它们不像大肠杆菌，粪便不是其唯一的来源。其它以较低数量级存在于粪便中的菌也可以作为指示生物，比如肠球菌和产气荚膜梭菌。
饮用水、处理和未经处理的娱乐用水和环境水域的微生物检测的基本框架是建立在这些指标生物上，几十年的安全运行已经证明了这种方法的可靠和有效性，即将总大肠菌群、粪大肠菌群检测（大肠菌群能够生长在44oC）作为用于常规筛查粪便污染的指标。同时必须指出的是，指示生物若为阴性并不能保证水系统中一定没有病原体。因为无论是病原体，还是指示生物都不能在水中无限期的生存，特别是在水环境中受到氯化物或高浓度的紫外线辐射的条件下。
尽管指标生物检测被证明是可靠有效的，但在某些特殊情况下，仍有必要直接检测在水系统传播的病原体。例如，对公共饮用水系统进行常规的隐孢子虫监测，因为此种病菌曾在发达国家造成过疾病的爆发；再比如对冷却塔和加湿器中进行军团菌检测，因为它的存在会导致水气雾剂中包含该菌的气溶胶；此外在处理过的水，如游泳池等场所，需要进行铜绿假单胞菌的检测。
水质参数
除了直接对指示生物和某些特定的病原体检测外，非选择性异养菌落计数也是一种监测方法。一般选择在两个温度（22oC和37oC）下进行菌落计数对比，当水中的微生物数量发生异常波动，往往说明水质发生了变化。而之前仅在37oC下对水体微生物计数用以表示粪便污染，现在被认为是不可靠的。
采样
获得具有代表性的水样是分析水中微生物的重要环节，首先样品应收集在无菌容器中，若水中含氯还需加入适量的硫代硫酸钠，以中和残留的氯；其次要确保采样器自身没有污染，且在采样时必须穿戴灭菌橡胶手套等防护措施以防止带入外来污染的情况。最理想的采样是利用卫生设计的水龙头直接从管道分配系统或水箱中收集水样。同时考虑到细菌可能在水龙头中生长，建议在采样前用酒精或合适的消毒剂对水龙头进行消毒。在收集前，还需先释放一部分水，让其从龙头里流出，以冲洗龙头内可能的污染，最终确保采集的样品是具有代表性的，同时在样品采集完后应尽快进行检测。
需要注意的是采水样的操作随着取样类型和位置的不同而发生变化，其中有很多需要注意的因素。关于分样点分布和其他水源取样的综合性意见，可以参考一些指南，如英国环境局工作手册《The Microbiology of Drinking Water (2010) - Part 2 - Practices and procedures for sampling》和美国环保局的《Interactive Sampling Guide for Drinking Water System Operators》，里面
对微生物的采样相关程序都做了相应规定。
生物膜
近年来，人们越来越意识到水系统中由微生物种群形成生物膜的重要性。生物膜现在被公认为是在固体表面上形成的复杂的微生物群落。生物膜通常由多种微生物细胞组成，包括潜在的病原体，以及一些细菌分泌的胞外多糖基质（EPS）共同形成。随着时间的推移，生物膜的构成越来越复杂和广泛，并且可以保护其中单个细菌细胞免受水中的氯和其他抗菌化合物的影响。生物膜也很难从表面去除，同时它还可以作为微生物污染的源头，释放“先驱细胞”（Pioneer cells）从而污染整个水体。研究表明，饮用水系统中的绝大多数细菌都存在于生物膜中，而不是自由生活在水里。在生物膜中分离到的病原菌有沙门氏菌、空肠弯曲菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌等。生物膜会影响水质，引起异味，并加速系统腐蚀。如果水系统存在显着的生物膜增长，还可能会使得我们难以获得有代表性的水样，并影响微生物分析的结果。
研究揭示，高异养板计数（High heterotrophic plate counts）可能可以揭示水系统中存在的生物膜的形成。在某些情况下，可能需要直接使用拭子获得生物膜样本，或者可以让生物膜长在可移动的金属片表面，也可以在特别设计的部分管道内的生长。（更多关于生物膜的相关知识，可关注本公众号后选择“查看历史消息”，在往期推送中可以查到我们关于生物膜更详细的专题文章。）
微生物检测方法
对水中的指示生物或者病原微生物检测，传统的培养倒铺平板计数的方法仍是常规用于检测微生物的手段，但却有不够灵敏的局限性，因而需要能够有针对更大容量水（通常为100ml）的方法进行检测。一直以来，实验人员多选择的是MPN（most probable number）技术，即水样被加到一系列含不同培养基的设备中培养。培养基中的颜色变化表明微生物生长，同时微生物数量也可以从中计算得到。该方法虽然简单、价格低廉，但却操作繁琐且耗费人力，同时还需要大量的培养空间。另外这也是一种间接的检测方法，无法进一步鉴定个别菌落。目前，MPN检测很大程度上已被膜过滤法所取代（MF）。
膜过滤方法（MF）
典型的用于水分析的膜过滤方法是将已知体积的水通过一个孔径小的足以限制细菌通过的无菌纤维膜（通常为0.45μm）。然后将过滤膜放置在无菌的琼脂平板表面或放入到合适的选择性液体培养基进行培养。菌落可以在滤膜表面生长，并且可以直接计数和检测。同时随着研究的深入和技术的发展，目前我所也可以利用基因测序的方法，无需培养而直接对滤膜上的微生物进行检测，从而大大扩大了可检测的范围，也突破了培养的局限性。
MF方法的特点是快速和容易执行，具有在对大量水进行检测时所需的培养空间小等优点。在过去的30年中，MF方法已经成为水系统微生物检验（用于指示生物）的首选方法。很多官方公布的方法也是基于MF，尤其是ISO系列的标准方法，如ISO 9308-1大肠菌群、大肠杆菌，7899-2肠球菌等。
实验室常规检测饮用水、娱乐用水和环境样品应遵循并使用当地主管机构推荐的官方方法。在设备方面，MF的方法需要适当的过滤装置，这些各种各样的过滤系统在市场上均有销售。各种膜过滤器可用于不同的应用，但微生物水分析通常使用孔径为0.45μm的滤膜。
培养基
许多选择性培养基被应用于从MF方法收集到的指示微生物的培养和检测。如：对大肠菌群和大肠杆菌推荐的培养基包括膜烷基硫酸盐肉汤或琼脂，MI琼脂和肉汤和乳糖醛酸琼脂膜。膜肠球菌琼脂（MEA）和膜肠球菌吲哚-?-D-葡萄糖苷琼脂（mEI）可用于检测和计数肠球菌，而胰蛋白亚硫酸盐环丝氨酸琼脂（不添加蛋黄）可以用来培养产气荚膜梭菌。铜绿假单胞菌也可以通过使用MF法结合铜绿假单胞菌琼脂进行检测。
当发现可疑菌落时，可再采用进一步的培养以及生化检测等方法来确认。越来越多的显色荧光培养基也被用于水体微生物检测，它们是基于目标细菌的特异性酶的显色，生产高诊断的显色克隆，这些培养基相比其他培养基，选择性条件不苛刻，还能避免更少的假阴性结果，并可减少检测时间。
快速检测方法
虽然官方推荐的水体微生物分析方法仍然依靠传统的培养和MF的方法，但是由于其在检测速度和检测的灵敏性上也存在一定的局限性，目前大多研究注意力已经集中在其他的快速方法上。如流式细胞仪、免疫磁分离的研究，但以分子生物学为基础的方法，特别是利用定量PCR（qPCR）技术，基因测序技术，对指示生物（如大肠杆菌的检测）和特定的病原体都显示出了特别好的前景。MF和qPCR检测的结合已被证明是一个特别快速分析水样的有效手段。当然，该方法也有一定的弊端，比如可以将死菌检测到，同时也会高估菌种的数量。
针对这些弊端，我所经过研究实践，已成功开发出一套靶向检测活菌的技术，很好的解决了定量PCR技术的这一缺点。总体看来，实时荧光定量PCR方法将在水系统微生物检测中变得越来越重要，随着相关商业产品的研究和开发，更快速更准确的检测方法将不断被完善。
