本方法规定了水产品中硝基呋喃类代谢物快速检测方法。
本方法适用鱼肉、虾肉、蟹肉等水产品中呋喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃西林代谢物（SEM）、呋喃妥因代谢物（AHD）的快速测定。
2 原理
样品中硝基呋喃类代谢物经衍生处理后，其衍生物与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡/试纸条中检测线（T线）上硝基呋喃类代谢物-BSA偶联物的免疫反应，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中硝基呋喃类代谢物进行定性判定。
3 试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1 试剂
3.1.1 盐酸。
3.1.2 三水合磷酸氢二钾。
3.1.3 氢氧化钠。
3.1.4 甲醇。
3.1.5 乙醇。
3.1.6 乙腈。
3.1.7 邻硝基苯甲醛。
3.1.8 三羟甲基氨基甲烷。
3.1.9 乙酸乙酯。
3.1.10 正己烷。
3.1.11 邻硝基苯甲醛溶液（10mmol/L）:准确称取0.150g邻硝基苯甲醛，用甲醇（3.1.4）溶解并定容至100mL。
3.1.12 磷酸氢二钾溶液（0.1mol/L）：准确称取22.822g三水合磷酸氢二钾（3.1.2），用水溶解并定容至1000mL。
3.1.13 氢氧化钠溶液（1mol/L）：准确称39.996g氢氧化钠（3.1.3），用水溶解并稀释至1000mL。
3.1.14 盐酸溶液（1mol/L）：取10mL盐酸（3.1.1）加入到110mL水中。
3.1.15 三羟甲基氨基甲烷溶液（10mmol/L）：准确称取1.211g三羟甲基氨基甲烷（3.1.8），溶于80mL水中，加入盐酸（约42mL）调pH至8.0后用水定容至1L。
3.2 参考物质
3.2.1 硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥99%。
表1 硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量
注：或等同可溯源物质。
3.3 标准溶液的配制
3.3.1 标准储备液：分别准确称取适量参考物质（精确至0.0001g），用乙腈溶解，配制成100mg/L的标准储备液。-20℃冷冻避光保存，有效期12个月。
3.3.2 混合中间标准溶液：准确移取标准储备液（3.3.1）各1mL于100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为1mg/L的混合中间标准溶液。4℃冷藏避光保存，有效期3个月。
3.3.3 混合标准工作溶液：准确移取0.1mL混合中间标准溶液（3.3.2）于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为0.01mg/L的混合标准工作溶液。4℃冷藏避光保存，有效期1个月。
3.4 材料
3.4.1 AOZ试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。
3.4.2 AMOZ试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。
3.4.3 SEM试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。
3.4.4 AHD试剂盒（含胶体金试纸条或检测卡及配套的试剂）。
3.4.5 固相萃取柱（强阴离子交换型）：规格1mL，填装量为60mg。
4 仪器和设备
4.1 电子天平：感量分别为0.1g和0.0001g。
4.2 均质器。
4.3 水浴箱。
4.4 离心机。
4.5 氮吹仪或空气吹干仪。
4.6 移液枪：10?L，100?L，1000?L，5000?L。
4.7 涡旋振荡仪。
4.8 胶体金读数仪（可选）。
4.9 固相萃取装置（可选）。
4.10 环境条件：温度15-35℃，湿度≤80%。
5 分析步骤
5.1 试样制备
按照方法要求，称取一定量具有代表性样品可食部分（注：甲壳类，试样制备时须去除头部），用于后续实验。
5.2 试样提取和净化
称取适量的匀浆样品（以试剂盒操作说明书要求来定，精确至0.01g）于50mL离心管。
5.2.1 方法一（液液萃取法）
称取2g±0.05g均质组织样品于50mL离心管中，依次加入4mL去离子水、5mL1mol/L盐酸（3.1.14）和0.2mL10mmol/L邻硝基苯甲醛溶液（3.1.11），充分振荡3min；将上述离心管在60℃水浴下孵育60min；依次加入5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（3.1.12），0.4mL1mol/L氢氧化钠溶液（3.1.13），乙酸乙酯6mL，充分混合3min，在室温（20-25℃）下4000r/min，离心5min；移取离心后的上层液体3mL于5mL离心管中，60℃下氮气/空气吹干；向吹干的离心管中加入2mL正己烷，振荡1min，然后加入0.5mL 10mmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液（3.1.15），充分混匀30s，室温下4000r/min，离心3min（或静置至明显分层）；下层溶液即为待测液。
5.2.2 方法二（固相萃取法）
称取6g±0.05g均质组织样品于50mL离心管中，依次加入4mL去离子水、5mL1mol/L盐酸（3.1.14）和0.2mL10mmol/L邻硝基苯甲醛溶液（3.1.11），充分振荡3min；将上述离心管在60℃水浴下孵育60min；依次加入5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（3.1.12），0.4mL1mol/L氢氧化钠溶液（3.1.13），乙酸乙酯6mL，充分混合3min，在室温（20-25℃）下4000r/min，离心5min；移取离心后的上层液体3mL于15mL离心管中，加入10mL10%乙酸乙酯-乙醇溶液，上下颠倒混合4-5次，4000r/min离心1min（底部会有部分沉淀）。连接好固相萃取装置，并在固相萃取柱（3.4.5）上方连接30mL注射器针筒，将上述上清液全部倒入30mL针筒中，用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使注射器中的液体全部流过固相萃取柱，再重复推压注射器活塞2次，以尽可能将固相萃取柱中的溶液去除干净。将固相萃取柱下方的接液管更换为洁净的离心管，再向固相萃取柱中加1mL10mmol/L三羟甲基氨基甲烷溶液（3.1.15）。用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使固相萃取柱中的液体全部流至离心管中后，离心管中的液体即为待测液。
5.3 测定步骤
5.3.1 试纸条与金标微孔测定步骤
吸取适量样品待测液于金标微孔中，抽吸5-10次混合均匀，室温（20-25℃）温育5min，将试纸条吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育3-6min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。
5.3.2 检测卡测定步骤
吸取适量样品待测液于检测卡的样品槽中，室温（20-25℃）温育5-10min，直接进行结果判定。
5.4 质控试验
每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。
5.4.1 空白试验
称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
5.4.2 加标质控试验
准确称取空白样品适量（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，加入适量硝基呋喃类代谢物标准工作液，使其浓度为0.5?g/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
6 结果判定要求
结果的判断也可使用胶体金读数仪判读，读数仪的具体操作与判读原则请参照读数仪的使用说明书。采用目视法对结果进行判读，目视判定示意图如图1和图2所示。
6.1 比色法
6.1.1 无效
控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。
6.1.2 阳性结果
检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中硝基呋喃类代谢物高于方法检测限，判为阳性。
6.1.3 阴性结果
检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中硝基呋喃类代谢物低于方法检测限或无残留，判为阴性。
6.2 消线法
6.2.1 无效
控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。
6.2.2 阳性结果
检测线（T线）不显色，表明样品中硝基呋喃类代谢物高于方法检测限，判为阳性。
6.2.3 阴性结果
检测线（T线）与控制线（C线）均显色，表明样品中硝基呋喃类代谢物低于方法检测限或无残留，判为阴性。
6.3 质控试验要求
空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。
7 结论
当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。
8 性能指标
8.1 检测限：AOZ、AMOZ、SEM、AHD均为0.5?g/kg。
8.2 灵敏度：灵敏度应≥95%
8.3 特异性：特异性应≥95%。
8.4 假阴性率：假阴性率应≤5%。
8.5 假阳性率：假阳性率应≤5%。
注：性能指标计算方法见附录A。
9 其他
本方法的测定步骤和结果判读也可以根据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。本标准参比方法为GB/T 21311《动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱/串联质谱法》。
附录A
快速检测方法性能指标计算表
表A.1 性能指标计算方法
