热搜: 食品  奶粉  烟台  海产品  保健品  周黑  黑窝点  黑作坊  全聚德  小龙虾 
 
当前位置: 首页 » 检测应用 » 分析应用 » 生命科学应用 » 正文

病毒的培养检测

放大字体  缩小字体 发布日期:2017-04-29
核心提示:病毒的培养检测
   病毒研究的发展常常与病毒培养和检测方法的进步有密切的关系,特别在脊椎动物病毒方面,小鼠和鸡胚接种、组织培养、超速离心、凝胶电泳、电子显微镜和免疫测定等技术,对病毒学的发展具有深刻的影响。
 
  噬菌体的培养和检测方法最为简单。将噬菌体接种到易感细菌的肉汤培养物中,经18~24小时后,混浊的培养物重新透明,此时细菌被裂解,大量噬菌体被释放到肉汤中,再经除菌过滤,即为粗制噬菌体。为了测定其中噬菌体的数量,将粗制噬菌体稀释到每一接种量含100个左右,与过量的细菌混合,然后铺种于琼脂平皿上,在温箱中培养过夜,细菌繁殖成乳白色衬底,被噬菌体裂解的区域则在此衬底上表现为圆形的透明斑,称为噬斑。噬斑数代表该接种量中有活力的噬菌体数量。如果挑出单个噬斑来培养,就能获得由单个噬菌体所繁殖的后代,达到分离纯化的目的。
 
  动物病毒(见脊椎动物病毒)的培养可在自然宿主、实验动物、鸡胚或细胞培养中进行,以死亡、发病或病变等作为病毒繁殖的直接指标,或以血细胞凝集、抗原测定等作为间接指标。收获发病动物的组织磨成悬液或有病变的细胞培养液,即为粗制病毒。测定活病毒数量可采用空斑法,其原理与噬斑法相同,但以易感的动物单层细胞代替细菌,在接种适当稀释的病毒后,用含有培养液和中性红的琼脂覆盖,使病毒感染局限在小面积内形成病变区,衬底的健康细胞被中性红染成红色,病变区不染色而显示为空斑。
 
  至今植物病毒的培养和检测大都是在整株植物上进行的。从捣碎的病叶汁中制备病毒,常用枯斑法检测。用手指蘸上混有金刚砂的稀释病毒在植物叶片上轩轻摩擦,经一定时间后出现单个分开的圆形坏死或退绿斑点,称为枯斑。
 
  除了利用病毒的致病性定量检测病毒外,还可应用物理方法,如在电子显微镜下计数病毒颗粒,或用紫外分光光度计测定提纯病毒的蛋白和核酸量,这些方法所测得的数据包括了有感染性和无感染性的病毒粒。
 
  应用电子显微镜不但能看清病毒粒的大小、形态,还可以分辨其表面的蛋白亚单位和内部的核壳等超微结构。DNA
 
  大小与形态
 
  不同病毒的大小变动于20~450纳米之间。最大的为痘病毒科,大小为(170~260)×(300~450)纳米,最小的为双联病毒科,直径18~20纳米。
 
  病毒的形态也是多样的:球状(包括二十面体),如脊髓灰质炎病毒和有包膜的如疱疹病毒;杆状(包括棒状),如烟草花叶病毒;丝状,如甜菜黄花病毒;弹状,如水疱性口炎病毒;复杂构型,如蝌蚪状的T偶数噬菌体。有些病毒在细胞内呈自然晶体排列。
 
  化学组成
 
  核酸是带有遗传密码的病毒基因组。病毒依所含核酸种类不同可分为DNA病毒和RNA病毒。动物病毒或含DNA,或含RNA;植物病毒除少数组外大多为RNA病毒;噬菌体除少数科外大多为DNA病毒。
 
  DNA或RNA可以是线型的或环状的,可以是单链的或双链的。RNA可以分节段或不分节段,单链RNA又分正链的和负链的。
 
  在分节段的RNA植物病毒中,常见多分体基因组,即同一病毒的几个RNA节段分别装入衣壳中,形成大小不同的颗粒,有的分装在两种颗粒中称二分体基因组,如豇豆花叶病毒;有的分装在3种颗粒中称三分体基因组,如黄瓜花叶病毒和雀麦花叶病毒。
 
  通过遗传学和生物化学方法,已查明一些病毒的基因图谱。对MS2和ΦΧ174噬菌体。花椰菜花叶病毒、SV40和乙型肝炎病毒核酸的核苷酸序列,已全部查明。
 
  ①蛋白质病毒的主要组分,依其功能可分为衣壳蛋白、膜蛋白、糖蛋白和内在酶4类。
 
  衣壳蛋白包裹核酸形成保护性的外壳,简单的病毒只有1种衣壳蛋白,较复杂的如腺病毒衣壳是由六邻体、五邻体和纤维3种蛋白构成。在有包膜的病毒如流感和水疱性口炎病毒中,膜蛋白一方面与外层脂质相连结,另一方面又同内部的核壳相连结,起到维系病毒内外结构的作用。糖蛋白位于包膜表面,有的形成突起,如流感病毒的血凝素,能与细胞膜受体结合。病毒虽无完整的酶系统,但常含有一些特殊的酶,如流感病毒的神经氨酸酶和噬菌体的溶菌酶。此外,呼肠孤病毒科、弹状病毒科、正粘病毒科和副粘病毒科病毒粒中含RNA多聚酶,反录病毒科含反转录酶,均与核酸复制有关。已查明十几种病毒蛋白的全氨基酸序列。
 
  ②脂质存在于包膜中,包膜是在病毒成熟时从细胞质膜或核膜芽生获得的,所以病毒脂质常具有宿主细胞脂质的特征。用有机溶剂或去污剂破坏包膜脂质,可使病毒粒裂解。
 
  ③糖除核酸中的戊糖外,病毒包膜还含有与蛋白或脂质结合的多糖。
 
  烟草花叶病毒、流感病毒和枯草杆菌噬菌体的电子显微镜照片和结构模式图(见植物病毒、正粘病毒科和细菌病毒)。
 
  复制
 
  病毒复制指病毒粒入侵宿主细胞到最后细胞释放子代毒粒的全过程,包括吸附、进入与脱壳、病毒早期基因表达、核酸复制、晚期基因表达、装配和释放等步骤。各步的细节因病毒而异。
 
  吸附与进入
 
  T4噬菌体先以其尾丝与大肠杆菌表面受体结合,随后尾鞘收缩,裸露出的尾轴穿入细菌外壁,把头部内储存的DNA注射到细菌体内。动物病毒也是先与细胞受体结合,以后或是靠细胞的吞噬作用进入,或是病毒包膜与细胞质膜融合后使核壳进入。植物病毒则是通过伤口侵入或通过媒介昆虫直接注入。一般情况下,病毒均须经脱壳,即脱去外被的蛋白质释放核酸,才能进行下一步复制。
 
  基因表达
 
  将其核酸上的遗传信息转录成信使核糖核酸(mRNA),然后再翻译成蛋白质。一般在核酸复制以前的称早期基因表达,所产生的早期蛋白质,有的是核酸复制所需的酶,有的能抑制细胞核酸和蛋白质的合成;在核酸复制开始以后的称晚期基因表达,所产生的晚期蛋白质主要是构成毒粒的结构蛋白质。早期和晚期蛋白质中都包括一些对病毒复制起调控作用的蛋白质。
 
  转录
 
  因病毒核酸的类型而异,共有6种方式:双链DNA(dsDNA)的病毒如SV40,其转录方式与宿主细胞相同;含单链DNA(ssDNA)的病毒如小DNA病毒科,需要通过双链阶段后再转录出mRNA;含单链正链RNA(ss+RNA)的病毒如脊髓灰质炎病毒、烟草花叶病毒和Qβ噬菌体,其RNA可直接作为信使,利用宿主的蛋白质合成机器合成它所编码的蛋白质;含单链负链RNA(ss-RNA)的病毒如水疱性口炎病毒和流感病毒,需先转录成互补的正链作为其mRNA,ssRNA的反录病毒如鸡肉瘤病毒和白血病病毒,需先经反转录成dsDNA而整含到宿主染色体中,于表达时再转录成mRNA,含dsRNA的呼肠孤病毒,则以保守型复制方式转录出与原来双链中的正链相同的mRNA。
 
  有些病毒(如腺病毒和SV40)的基因是不连续的,有外显子与内含子之分,转录后有剪接过程,把内含子剪除而把外显子连接起来,才有mRNA的功能。多数病毒的mRNA还需经过其他加工,如在5′端加上“帽子”结构和在3′端加上多聚腺嘌呤核苷酸。
 
  病毒基因转录所需酶的来源也不相同,如小DNA病毒科、乳多泡病毒科所需依赖于DNA的RNA多聚酶,都是利用宿主原有的酶;而弹状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科和呼肠孤病毒科所需的依赖于RNA的RNA多聚酶,以及反录病毒科所需的反转录酶,都是病毒粒自备的。
 
  翻译
 
  不同病毒mRNA翻译的方式是不同的。一般认为噬菌体的翻译是多顺反子的,如Qβ的RNA上有3个顺反子(为单个肽链编码的基因功能单位),可沿着1条mRNA独立地翻译出3种多肽。动物病毒的翻译是单顺反子的,即由其基因组转录成不同的mRNA,每种mRNA翻译成一种多肽。分节段基因组病毒如流感病毒和呼肠孤病毒,每1节段RNA构成1个顺反子,多分体基因组的植物病毒也是如此。脊髓灰质炎病毒的mRNA先被翻译成1个分子量为20万的巨肽,再经裂解成为衣壳蛋白和酶。
 
  有些病毒如ΦΧ174,Qβ噬菌体和SV40等,存在基因重叠现象,即按读码位相不同而从同一核苷酸序列可以表达出一种以上的蛋白质。这是病毒经济地利用其有限的遗传信息的1种方式。
 
  核酸复制
 
  DNA病毒按照经典的沃森-克里克碱基配对方式进行DNA复制。乳多泡病毒的环状 DNA按“滚环”模式进行复制时,需要有核酸内切酶和连接酶参与。病毒RNA是通过半保留方式复制的,即以病毒RNA(vRNA)为模板,同时转录几个互补链(cRNA),cRNA转录完成并脱落后,又以同样方式再转录出新的vRNA。因此,在感染细胞中可以查出具有部分双链结构而又拖着多条长短不同单链“尾巴”(正在合成中的互补链)的“复制中间体”。
 
  病毒核酸复制所需酶的来源也各不相同。SV40DNA合成所需的酶都来自宿主。含RNA的Qβ噬菌体、小RNA病毒科和含ssRNA的植物病毒所需RNA多聚酶的某个亚基,可能由病毒基因编码,而其他亚基来自宿主。疱疹病毒DNA复制所需的酶,部分地由病毒编码,如DNA多聚酶和胸苷激酶,可能还有核苷酸还原酶。痘类病毒的独立自主能力最强,甚至能在去核细胞中进行DNA复制,其基因组至少能为75种蛋白质编码,包括DNA多聚酶、胸苷激酶、脱氧核糖核酸酶和聚核苷酸连接酶。
 
  装配与释放
 
  病毒核酸和结构蛋白是分别复制的,然后装配成完整的病毒粒。最简单的装配方式(如烟草花叶病毒)是核酸与衣壳蛋白相互识别,由衣壳亚单位按一定方式围绕RNA聚集而成,不借助酶,也无需能量再生体系。许多二十面体病毒粒先聚集其衣壳,然后再装入核酸。有包膜的病毒,在细胞内形成核完后转移至被病毒修饰了的细胞核膜或质膜下面,以芽生方式释放病毒粒。T4噬菌体则先分别装配头部、尾部和尾丝,最后组合成完整病毒粒,裂解细菌而释放,其中有些步骤需酶的作用。
 
  细胞水平上的感染类型和宿主反应
 
  很早发现噬菌体感染有裂解性和溶源性之分。以大肠杆菌的λ噬菌体为例,裂解性感染于经历上述复制周期后产生大量子代病毒粒而将细菌裂解;而溶源性感染时,噬菌体DNA环化并整合到大肠杆菌DNA的特异性位点上,随着细菌的分裂而传给子代细菌,细菌不被裂解也不产生子代病毒粒。营养条件、紫外线或化学药物都能使溶性源感染转化为裂解性。动物的DNA病毒如 SV40、腺病毒、疱疹病毒等于感染敏感细胞(称为容许细胞)后,形成裂解性感染,而于感染不大敏感的细胞(称为不容许细胞)后,则形成转化性感染。转化性感染与溶源性感染相似,病毒DNA或其片段整合于细胞染色体上,并随细胞分裂而传给子代细胞,表达其部分基因(一般为早期基因),但不产生子代病毒粒,细胞也不死亡,但被转化成类似于肿瘤细胞,可无限地传代。另一方面,RNA肿瘤病毒(如鸡肉瘤病毒)必须先将其RNA反转录成dsDNA并整合到细胞染色体上,才能进行复制,所以这种感染方式是独特的,既是转化性感染,又产生大量病毒粒。
 
  宿主细胞对病毒感染的反应有4种:无明显反应、细胞死亡、细胞增生后死亡和细胞转化。例如,副粘病毒SV5在细胞培养中产生大量病毒而不引起明显反应。多数病毒感染敏感细胞时,由于抑制了细胞核酸和蛋白质合成而引起细胞死亡。痘病毒感染时,先刺激细胞多次分裂然后死亡,造成痘疱病灶。DNA病毒和RNA肿瘤病毒则引起细胞转化。
 
  有些动物病毒于感染宿主细胞后,在胞核或细胞质内形成具有特殊染色特性的内含物,称为包涵体,如痘病毒的细胞质内包涵体和疱疹病毒的胞核内包涵体。这些包涵体有的是由未成熟或成熟的病毒粒构成,有的是宿主细胞的反应产物,有的是两者的混合物。有些昆虫病毒的病毒粒包埋在蛋白基质中,形成包涵体如核型多角体病毒。
 
  脊椎动物细胞感染病毒后的另一种反应是产生干扰素。干扰素是一种动物细胞编码的蛋白,其基因平常处于不活动状态,于病毒感染或经双链RNA诱导后活化。干扰素有广谱的抗病毒作用,但并不直接作用于病毒,其作用机制是通过与细胞膜结合,激活具有抗病毒作用的3种酶,阻断了病毒mRNA的翻译。干扰素在防止病毒扩散和疾病恢复中有一定作用,并有可能成为一种抗病毒药物。
 
  机体水平上的感染类型和宿主反应
 
  高等动、植物感染病毒后,可表现为显性感染和持续感染,动物病毒还可表现为隐性感染。隐性感染无临床症状,显性感染表现为临床疾病;在持续感染中,病毒在机体内长期存在。动物病毒的持续感染又分为潜伏感染、慢性感染和长程感染3类。潜伏感染如疱疹,平常无症状也查不到病毒,但由于内外因素的刺激而复发时出现病毒;慢性感染如乙型肝炎,有或无症状,但可查到病毒;长程感染限于少数病毒,如绵羊的Maedi-visna(一种反录病毒感染)可查到病毒;潜伏期和病程都很长,进行性发病直至死亡。
 
  高等动物能对病毒感染产生特异性免疫反应。免疫反应分为体液免疫和细胞免疫两类,体液免疫表现为由B细胞产生的抗体,其中包括能特异地灭活病毒的中和抗体。中和抗体在预防再感染中起主导作用。细胞免疫的主要表现是识别病毒抗原并发生反应的T淋巴细胞,在清除病毒和病毒感染细胞中起主导作用。
 
  植物细胞对病毒常有过敏反应,细胞迅速死亡,形成枯斑,同时病毒复制也受到限制。另一种反应是产生一种很象干扰素的抗病毒因子,能保护未受感染的细胞。
 
  比如:EV71肠道病毒
 
  据专家介绍,肠道病毒EV71是人肠道病毒的一种,简称EV71,俗称手足口病,一年四季都可发生,常见于4~9月,主要通过唾液、疱疹液、粪便污染的手、毛巾、手绢、牙杯、玩具、食具、奶具及床上用品、内衣等密切接触传播,常引起儿童手足口病、病毒性咽峡炎,重症患儿可出现肺水肿、脑炎等,统称为肠道病毒EV71感染疾病。该病多发生于儿童,尤其3岁以下婴幼儿多发,少数病情较重,严重的会引起死亡。
 
  患儿感染肠道病毒EV71后,多以发热起病,一般为38℃左右,发热同时在口腔、手足、臀部出现皮疹,或出现口腔粘膜疱疹。
 
  部分病人早期有咳嗽等感冒样表现。发热1~2天后开始出现皮疹,通常出现在手掌和足底,也可以出现在臀部。有的患儿不发热,只表现为手、足、臀部皮疹或疱疹性咽峡炎,病情较轻。大多数患儿在一周以内体温下降、皮疹消退,病情恢复。
 
  中国疾病预防控制中心专家介绍说,如果发现孩子发烧、有皮疹等症状,尽快到正规医院就诊。孩子患病后应暂停去幼儿园和学校,避免传染给他人,防止再感染其他疾病。
 
  专家强调,患儿的家庭应使用肥皂、84消毒液对日常用品、玩具、尿布进行消毒,对奶具、餐具煮沸消毒。患儿粪便及其他排泄物可用消毒剂或漂白粉消毒;将衣被阳光暴晒,室内保持通风换气。
 
  春夏是肠道病毒感染容易发生的季节,要讲究环境卫生、食品卫生和个人卫生。不喝生水、不吃生冷食物,饭前便后洗手,保持室内空气流通。尽量不要带婴幼儿去人群密集的场所。哺乳的母亲要勤洗澡、勤换衣服,喂奶前要清洗奶头。
 
  在托幼机构、小学等儿童集体生活、学习的场所,专家建议要做好晨间体检,发现有发热、皮疹的孩子,要立即要求家长带小孩去医院就诊,同时报告相关部门。如发现有发热、皮疹的孩子后,要立即对玩具、被褥、桌椅等进行消毒;同时做好食堂、卫生间、教室等的消毒处理。
 
 
[ 检测应用搜索 ]  [ 加入收藏 ]  [ 告诉好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 违规举报 ]  [ 关闭窗口 ]

 
0条 [查看全部]  相关评论

 
推荐图文
推荐检测应用
点击排行
  

鲁公网安备 37060202000213号