本方法规定了水产品中硝基呋喃类代谢物快速检测方法。
本方法适用鱼肉、虾肉、蟹肉等水产品中呋喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃西林代谢物（SEM）、呋喃妥因代谢物（AHD）的快速测定。
2 原理
待测样中硝基呋喃类代谢物经衍生处理后，其衍生物与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素膜检测线上硝基呋喃类代谢物-BSA偶联物的免疫反应，使检测线颜色变浅，通过检测线与对照线颜色深浅比较，对样品中硝基呋喃类代谢物的含量进行定性判定。
3 试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1 试剂
3.1.1 盐酸。
3.1.2 三水合磷酸氢二钾。
3.1.3 氢氧化钠。
3.1.4 甲醇。
3.1.5 乙醇。
3.1.6 乙腈。
3.1.7 邻硝基苯甲醛。
3.1.8 三羟甲基氨基甲烷。
3.1.9 乙酸乙酯。
3.1.10 正己烷。
3.1.11 固相萃取柱（强阴离子交换型）：规格1mL，填装量为60mg。
3.1.12 邻硝基苯甲醛溶液（10 mmol/L）:准确称取0.150g邻硝基苯甲醛，用甲醇（3.1.4）溶解并定容至100mL。
3.1.13 磷酸氢二钾溶液（0.1mol/L）：准确称取22.822g三水合磷酸氢二钾（3.1.2），用水溶解并定容至1000mL。
3.1.14 氢氧化钠溶液（1mol/L）：准确称40g氢氧化钠（3.1.3），用水溶解并稀释至1000mL。
3.1.15 盐酸溶液（1 mol/L）：取10mL盐酸（3.1.1）加入到110mL水中。
3.1.16 三羟甲基氨基甲烷溶液（Tris，10mmol/L）：准确称取1.211g三羟甲基氨基甲烷（3.1.8），溶于80mL水中，加入盐酸（约42mL）调pH至8.0后用水定容至1L。
3.2 参考物质
3.2.1 硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥99%。
表1 硝基呋喃类代谢物参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量
注：或等同可溯源物质。
3.3 标准溶液的配制
3.3.1 标准储备液：分别准确称取适量参考物质（精确至0.0001g），用乙腈溶解，配制成100mg/L的标准储备液，－30℃冷冻避光保存，有效期12个月。
3.3.2 混合中间标准溶液：准确移取标准储备液（3.3.1）各1mL于100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为1mg/L的混合中间标准溶液，4℃冷藏避光保存，有效期3个月。
3.3.3 混合标准工作溶液：准确移取0.1mL混合中间标准溶液（3.3.2）于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为0.01mg/L的混合标准工作溶液，4℃冷藏避光保存，有效期1个月。
3.4 材料
3.4.1 AOZ试剂盒（含胶体金试纸条及配套的试剂）。
3.4.2 AMOZ试剂盒（含胶体金试纸条及配套的试剂）。
3.4.3 SEM试剂盒（含胶体金试纸条及配套的试）。
3.4.4 AHD试剂盒（含胶体金试纸条及配套的试剂）。
4 仪器和设备
4.1 电子天平（d = 0.1 g～0.0001 g）。
4.2 均质器。
4.3 离水浴箱。
4.4 离心机。
4.5 氮气或空气吹干仪。
4.6 移液枪：10?L，100?L，1000?L，5000?L。
4.7 涡旋振荡仪。
4.8 胶体金读数仪（可选）。
4.9 固相萃取装置（可选）。
4.10 环境条件：温度15℃~35℃，湿度≤80%。
5 分析步骤
5.1 试样制备
按照方法要求，称取一定量具有代表性样品可食部分（注：甲壳类，试样制备时须去除头部），用于后续实验。
5.2 样品前处理
称取适量的匀浆样品（以试剂盒操作说明书要求来定，精确至0.01g）于50mL离心管。按照试剂盒提取步骤分别对阴性质控样、阳性质控样、待测样进行样品处理。
5.2.1 水产品方法一（液液萃取法）
称取2g±0.05g均质组织样品于50mL离心管中，依次加入4mL去离子水，5mL 1mol/L盐酸和0.2mL衍生化试剂（3.5.1），充分振荡3分钟；将上述离心管在75℃水浴下孵育30分钟；取出后依次加入5mL 0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（3.5.2），0.4mL 1mol/L氢氧化钠溶液（3.5.3）和6mL乙酸乙酯，充分震荡3分钟，在室温（20-25℃）下4000r/min,离心5分钟；移取离心后的上层液体3mL于5mL离心管中，60℃下氮气/空气吹干；向吹干的离心管中加入2mL正己烷，振荡1min，然后加入0.5mL复溶液（3.5.5），充分混匀30秒，室温下4000r/min，离心3分钟（或静置至明显分层）；下层溶液即为待测液。
5.2.2 方法二（固相萃取法）
称取6g±0.20g均质组织样品于50mL离心管中，加入5mL 1mol/L盐酸（3.5.4）和0.8 mL衍生化试剂（3.5.1），充分振荡30秒左右，在75℃水浴中孵育30分钟。然后加入10mL 0.1mol/L磷酸氢二钾（3.5.2）和5mL 20%乙腈-水溶液，振荡10-20秒，在室温（20-25℃）下4000 r/min离心2分钟。移取上清2mL于15mL离心管，加入10mL10%乙酸乙酯-乙醇溶液，上下颠倒混合4-5次，4000 r/min离心1分钟（底部会有部分沉淀）。连接好固相萃取装置，并在固相萃取柱上方连接30mL注射器针筒，将上述上清液全部倒入30mL针筒中，用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使注射器中的液体全部流过固相萃取柱（3.1.11），再重复推压注射器活塞2 次，以尽可能将固相萃取柱中的溶液去除干净。将固相萃取柱下方的接液管更换为洁净的离心管，再向固相萃取柱中加1mL复溶液（3.5.5）。用手缓慢推压注射器活塞，控制液体流速约1滴/秒，使固相萃取柱中的液体全部流至离心管中后，离心管中的液体即为待测液。
5.3 测定步骤
5.3.1 试纸条与金标微孔测定步骤
吸取一定量样品待测液于反应微孔中，抽吸 5～10 次使混合均匀，室温（20-25℃）温育5 min，将检测试纸条吸水海绵端垂直向下插入反应微孔中，温育 3～6 min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。
5.3.2 检测卡测定步骤
吸取一定量样品待测液于检测卡的样品槽中，室温（20-25℃）温育5～10 min，即可对结果进行判定。
5.4 质控试验
每一批次试验时，选取已知未含硝基呋喃类代谢物的均质组织水产品作为质控样，称取两份平行样，其中一份作为阴性质控样，另一份添加标准溶液使其终浓度为0.5?g/kg，作为阳性质控样。按照上述同样步骤进行实验。
6 结果判定
结果的判断也可使用胶体金读数仪判读，读数仪的具体操作与判读原则请参照读数仪的使用说明书。采用目视法对结果进行判读，目视判定示意图见图1和图1。判定原则如下：
6.1 比色法
6.1.1 无效
控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测板无效。
6.1.2 阳性结果
检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中硝基呋喃类代谢物高于方法检测限，判为阳性。
6.1.3 阴性结果
检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中硝基呋喃类代谢物低于方法检测限或无残留，判为阴性。
6.2 消线法
6.2.1 无效
控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测板无效。
6.2.2 阳性结果
检测线（T线）不显色，表明样品中硝基呋喃类代谢物高于方法检测限，判为阳性。
6.2.3 阴性结果
检测线（T线）与控制线（C线）均显色，表明样品中硝基呋喃类代谢物低于方法检测限或无残留，判为阴性。
图2 目视判定示意图（消线法）
6.3 质控试验要求
阴性质控样结果应为阴性，阳性质控样结果应为阳性，否则实验无效。
7 性能指标
7.1 检测限：AOZ、AMOZ、SEM、AHD均为0.5?g/kg。
7.2 灵敏度：灵敏度应≥95%
7.3 特异性：特异性应≥95%。
7.4 假阴性率：假阴性率应≤5%。
7.5 假阳性率：假阳性率应≤5%。
注：性能指标计算方法见附录A。
8 其他
本标准采用参比方法为GB/T21311。如被测样品中硝基呋喃类代谢物检测结果为阳性时，可根据需要采用参比方法进行确证检测。
本方法的测定步骤和结果判读也可以根据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。
相关公告：总局办公厅公开征求《水产品中孔雀石绿的快速检测 胶体金免疫层析法》（征求意见稿）等6项食品快速检测方法意见
