FTIR光谱技术检测牛奶中的酮体表明,与化学方法得到的结果具有较高的相关性,并且已经证实该方法对于筛查奶牛群中的酮病具有很好的效果。
从2011年4月,加拿大魁北克的Valacta开始向当地的养殖户提供酮病筛查服务,主要是基于检测牛奶中的Β-羟基丁酸。此项服务作为可选项并且需要付费。在2014年,大约71%的农民使用了该项服务,并且超过54%的奶牛都进行了酮病的筛查。在2011年,酮病的患病率由26%下降为2014年的15%。相比阴性(Β-羟基丁酸<0.15 mM/L),当奶牛提高Β-羟基丁酸(≥0.20 mM/L)时,会造成检测日减少2.4 kg的产奶量,并且牛奶中含有较高的脂肪含量和体细胞数,较低含量的蛋白和尿素含量。奶牛的繁殖性能也会严重受到酮病的影响:奶牛在早期泌乳期(超过24天)会提高Β-羟基丁酸的含量。此外,在下一个泌乳期,超过41%患有严重酮病的奶牛应该离开牛群。
在法国,CLASEL结合生物模型为FOSS提供丙酮和Β-羟基丁酸的定标方程,称为CetoDetect,通过定期预测牛奶样品,来预测奶牛患有酮病的风险。
定义范围为0-5,0代表动物健康;1和2位亚临床性酮病;3-5为临床性酮病。此外,酮病也会根据季节和饲料在10-30%范围内发生变化。较低数值与在春季牧场高质量的牧草有关,而较高数值与冬季提供的劣质青贮饲料有关。相比得分为5的奶牛,得分为0的奶牛产奶量较高,生育能力较好,并且牛奶中体细胞数量最低。酮病检测服务每年每头牛提供3次检测,并且大约50%的农民均使用了这项服务。
在荷兰,弗兰德斯和比利时,酮体的检测依然使用Qlip对牛奶的记录分析。FTIR预测丙酮和Β-羟基丁酸与少数几个奶牛相关的检测参数相结合,CRV进而通过二进制得分(是/否)用于酮病的筛查。为奶农提供的在泌乳期的前60天对奶牛酮病的得分,是通过牛奶记录报告,并且也用饲料公司对过渡时期和供应量的评估。在荷兰,酮病的爆发率为16%。酮病具有遗传性(遗传性为20%)。自从2014年12月酮病对育种价值的影响以来,已经作为CRV育种指标的一部分“让生活更美好,健康”这项新的服务提供常规的酮病得分筛查,主要针对于首次产奶的奶牛,采用此方法对奶农和饲料企业是非常有价值。
总之,通过对牛奶中丙酮和Β-羟基丁酸水平的检测用于酮病的筛查,可以清晰的知道泌乳早期代谢的变化,并对随后的泌乳期有着积极的影响。这项服务的投资回报率大约为10-1,并且还有对育种的附加值。酮病筛查对牛奶记录客户具有较高的价值,并且能够发现未知的问题。酮病筛查可以帮助降低发病率。
目前,在国内,有些实验室已经在采用FOSS的酮病模块来测定牛奶中的丙酮和BHB(β-羟基丁酸)指标,但在实际使用中,会遇到一些非常具体的应用问题,借此平台,我作以解答,
1. 实验室应该用什么参比方法对酮病模块两个指标,丙酮+β-羟基丁酸来定标?
FOSS最初开发酮病模块时候,采用的参比方法为使用SAN++仪器,采用分段流动法(Skalar, Breda, the Netherlands)。主要原理步骤如下:样品中的丙酮可以通过聚四氟乙烯膜气体扩散的方法进行测定。随后会与羟胺发生反应,导致pH的改变,此反应可以利用分光光度计在520nm处,以甲基橙作为指示剂进行检测(Skalar method, catalog number 110-363). 研究表明,其检测限为0.06mmol/L,重复性r的范围为0.06-1.5 mmol/L。
β-羟基丁酸利用牛奶样品缓冲液对Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲溶液(pH =9进行透析来测量。在3-羟基丁酸脱氢酶存在的条件下,β-羟基丁酸被氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型辅酶)氧化为乙酰乙酸盐和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原型辅酶)。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原型辅酶)
可以利用分光光度计在340 nm处进行测量(Skalar method, catalog number 388-301)。其检出限为0.04mmol/L,重复性范围为0.03-0.6 mmol/L。
对于含有防腐剂的测定样品,采用上述方法测定其酮体的含量与不含防腐剂的样品相比无显着性差异。
2.实际应用中,如何对FTIR设备的酮病模块进行定标调整?
如何可能,使用直接法和监控样品每月进行定标校准,直接法就是实验室对应的测定方法,监控样指具有真实值的牛奶样品.
但实际应用中,这种方法和监控样不容易获得,所以FOSS给大家推荐了一种比较实用的方法,即从统计学的角度,通过测定大量的样本来或者定标的调整数据,这种方法是基于我们的一个常识, 即健康奶牛丙酮含量应该为0, β-羟基丁酸的含量小于0.03mmol/L, 所以,我们可以通过测定大约2000份样品,通过测定指标丙酮和β-羟基丁酸指标含量的分布的情况,找到每个指标测定数据对应的中位数, 来做截距修正,而根本不需要调整斜率,平常测定中,每个月可随机选取50-100个样品,比较机器测定值和参比方法的差异来进行比对.这套方法体系在国外的许多合作实验已经成功使用,大家也可以参考.
3. 实际工作中,如何利用酮病模块测定的结果来作为筛查工具来指导牛场?
目前的酮病筛查工具属于半定量方法,需要结合其他信息综合使用,具体的指导原则如下:FOSS推荐,在机器测定结果判断中,丙酮的报警限为0.30 - 0.35 mmol/l ,β-羟基丁酸的报警限为0.25 mmol/l ,任何一个参数超过报警限,需要提高警惕, 同时采用咨询服务或者标准操作程序让奶农提高警惕, 还可以结合其他数据,利用数据分析确定奶牛是否有患有酮病的风险, FOSS在国外已经有了有相关的指导的一套材料,可以作为国内用户的参考.