Uu在含95% 氮气和5%CO2 环境中生长良好。其生长最适pH为5.5-6.5,最适温度为36℃-37℃。Uu具有尿素酶，能分解尿素产氨，使含酚红指示剂的Uu液体培养基pH值上升，颜色由黄色变为红色。再将液体培养物转种到Uu固体培养基上，能生长成具特征性油煎蛋样集落。
（1 ）液体培养基：支原体肉汤培养基80mL，马血清或小牛血清10mL，酵母浸液10mL,
10 %尿素溶液0.5mL-1.5mL, 0.4%酚红溶液0.5mL,青霉素（使其在培养基中的浓度为500U/mL-2000U/mL,）用1N HCl 调pH值至5.5-6.5, 用小试管分装后置冰箱中备用，每管1.5-2.0mL。
（2 ） 固体培养基：在100mL 支原体肉汤培养基中，加入琼脂1.2-1.4g, ,高压灭菌后冷却到 50 ℃左右，逐一加入上述添加剂。摇匀，倒入无菌平皿中，待凝固后，置冰箱中备用。
接种标本后，经孵育，若培养基发生由黄变红的颜色变化，透明无混浊（有别于某些细菌及 真菌生长）则可初步判断为有支原体生长。大多数Uu在24h内可获得阳性结果。如果培养基发生颜色变化，但液体又有混浊，则应排除杂菌污染, 可用0.45μm滤膜过滤后，作再接种观察。进一步诊断需将液体培养物接种到固体培养基上培养, 经Dienes法染色后在低倍显微镜下观察集落形态。阴性结果最好观察５天。Uu 在固体培养基上集落核心呈粗颗粒状,具极窄的边，有时呈油煎蛋样。如用 Dienes 法染色，集落为特异的蓝色。一般细菌的菌落不着色，容易鉴别。
（二）代谢抑制试验
根据特异性抗体能阻止支原体的生长和代谢这一特性，可用病人血清进行代谢抑制试验。在加有抗血清的培养基中，支原体的代谢受到抑制，从而阻止了培养基的颜色改变。
代谢抑制试验也可用于检测感染支原体患者血清抗体的滴度。即将血清作10倍连续稀释后，滴入支原体培养液，并以不加血清的支原体试验管和不加支原体液的培养基管作对照。经37℃培养，不加抗血清的培养管支原体应生长良好，培养基变成红色（Uu或Mh），未加支原体液培养基管颜色不变。未发生颜色变化的最高血清稀释度为代谢抑制试验的抗体滴度。
（三） 间接血凝试验
在一定条件下，抗体和相应抗原相遇，可形成抗原抗体复合物。这种复合物分子团很小,不能形成肉眼可见的反应。用经鞣酸处理的红细胞作载体，将抗原吸附在其表面，使红细胞致敏，待与相应的血清抗体相遇时，可出现肉眼可见的凝集现象。
（四）生长抑制试验
特异性抗体能阻止支原体的生长和代谢。用直径为6mm-8mm的圆形灭菌滤纸片，以未稀释抗血清浸透后放入无菌平皿内，于４℃下干燥后待用。 吸取待检菌液0.5mL涂布于固体培养基上，置３7℃使琼脂表面稍干燥。以无菌操作镊取抗血清纸片放于琼脂表面,培养4日-5日后,在低倍显微镜下观察滤纸片周围有无支原体生长。若滤纸片周围无菌落生长，出现抑菌圈大于2mm者表示该支原体与抗血清系同种免疫原，小于2mm判为异种。
（五）分子生物学诊断方法
目前主要应用聚合酶链反应（PCR）法及DNA探针技术作诊断。前者具有高度特异性和敏感性、且快速、简便。但操作要求极为严格。
聚合酶链反应的原理是DNA片段扩增，其中支原体引物的选择是PCR检测技术中的关键。1９９1年Willonghby 设计的引物来自脲酶基因。Zheng等（1995）用MB抗原基因引物对所有14个血清型的Uu均显示良好的PCR扩增效果，其敏感性较Willonghby设计的脲酶基因引物更好。
