ATP生物发光技术的发展与应用

ATP是化学物质三磷酸腺苷的简称，存在于所有的生物体中（从微生物到高等动物），ATP在细胞体内主要作用是提供能量。鉴于ATP存在于所有生物体中，利用ATP发光检测仪检测ATP，可以间接地证明生物体的存在。随着食品行业对食品卫生质量要求越来越高，而且ATP生物发光法在检测食品微生物时简单、快速且灵敏度高，因此近年来受到广泛关注。
 

ATP生物发光技术产生于20世纪70年代中期。1983年，Moyer等最早提出细胞内源性ATP的含量可以反映细胞的活性和活细胞的数量。同年Gronroos等也证实该技术是一种可靠、灵敏度高的确定细胞活性度的检测方法。20世纪80年代，英国人首先研制出ATP检测仪检测系统，随后发展到欧洲、美国和日本。应用范围涉及食品加工、超市和饮食行业，检测内容包括微生物和食品残渣。1998年，日本国会颁布了《关于食品制造过程管理高度化临时措施法》，其中即包含了应用ATP检测仪检测系统的内容。1999年，日本还成立了ATP涂抹检查研究会，专门研究该方法的使用效率和应用领域，其内容之一就是在食品卫生监测领域中，解决现场微生物的检测问题。20世纪末，一些ATP检测仪检测系统及技术被引进我国，到目前为止，除个别省级卫生监督检测单位装备外，主要是在一些外资或合资企业中自行检测使用。2002年，我国卫生部颁发了食品加工企业HACCP实施指南，鼓励食品加工企业引入ATP检测系统。近年来，虫荧光素酶已通过基因工程生产，价格大幅度降低，随着相关仪器的小型化，ATP生物发光技术必将会在国内相关行业得到迅速普及 。
 

2.1  ATP生物发光法菌落计数

ATP广泛存在于各种活的生物体中，活的菌体中也含有ATP。细菌死亡后，在细胞内酶的作用下，将很快被分解掉。ATP生物荧光检测是基于生物发光体系的发光机理所设计，萤火虫具有特殊的发光物质——虫荧光素及荧光素酶，荧光素易被氧化，它在荧光素酶催化下，由ATP激活，使之与氧结合，荧光素分子中的电子跃迁到高能级，处于不稳定的激发态，当电子跳回到低能级时，即发出荧光光子。该光的强度与被检测物质中所含的ATP量成正比，利用高灵敏度的仪器测定光的强度进行定量分析。因此，通过测定样品中ATP的浓度，即可推算出活菌数。生物发光法的检测步骤大体包括：棉拭取样、样品萃取、添加荧光素和荧光素酶混合物、测定生物发光量、做出标准曲线、求出浓度和活菌数。通常，细菌表层有细胞膜和细胞壁包裹，故样品未经处理是不能测定的。测定时需先将样品与微生物用提取试剂混合，使细胞膜和细胞壁开孔，提取出ATP提取试剂是以表面活性剂为基质的专用试剂。然后，再与荧光素和荧光素酶生物发光试剂作用，用荧光仪测定与发光试剂反应的生物发光量。

这种方法可自动化操作，灵敏度高，可以达到10-12 mol/L；检测速度快，相比表面皿培养法，仅需十几分钟就可以完成一个样本的检测；检测范围广，此种方法不仅可以检测微生物，还可以对食品生产设备的清洁度、酵母菌，乳酸菌等菌种的发酵活性等进行检测。沈阳中科靓马生物工程有限公司从中科院遗传与发育所引进了“含虫光素基因的新型菌株及虫光素酶的生产方法”发明专利，成功研发了具有我国自主知识产权的“ATP荧光法细菌总数快速检测系统”，系统采用了先进的ATP生物发光技术，只要测定出相对荧光值，依据相对荧光值与细菌总数的标准曲线，几分钟内即可快速得出样品中的细菌总数。2008年周爱玉等对手持式ATP生物荧光检测仪进行研制，取得了良好的结果。下图即是两款不同的类型，其中左侧被称之为掌上ATP发光法检测仪，使检测更加方便。

2.2 传统菌落技术法

菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
 

ATP生物发光法的应用范围十分广泛，现已应用于食品行业的多个领域。研究表明，ATP生物发光法与标准的细菌培养菌落计数法相比，二者具有良好的相关性(r=0.98)，但怎样细分细菌种类有一定的难度,还需要做大量的工作。利用这种方法可以对食品原料、肉类、水产品、蔬菜、饮料、酒类、酸奶等中微生物的含量进行定量。此外，采用ATP生物发光法可快速、简便地检测食品生产环境的清洁度。对ATP 含量的检测是以相对发光值(Relative Light Unit ,简称RLU)表示的。随着RLU值的降低，微生物的检出几率也降低。实验证明：如果将RLU值以100～1000作为界限，RLU值不满100时，微生物检出几率为0，RLU值在100～1000范围内时，微生物检出几率为30%，RLU值超过1000时，微生物检出几率为96%。根据这一结果，在日常对食品生产设备或与食品密切接触设备清洁度的检测时，可以将RLU值不满100时视为安全，RLU值在100～1000范围内时视为要引以重视和注意，RLU值超过1000时视为处于微生物污染的危险状态，因此ATP 生物发光法十分适HACCP系统的清洁度检测。此外，还可以用于酵母菌等对毒素的敏感性比较。近年来，ATP生物发光技术在国内外倍受推崇，在美、日等国食品行业的质量检测控制领域广泛应用，有效促进食品生产企业提高生产效率和经济效益，随着此方法不断改进和完善，生物发光法可望发展成为一种较为理想的微生物检测方法而得到更广泛的应用，以不断提高产品质量，确保食品质量安全。