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使用说明书
【用途】
用来检测鸡血清中的禽传染性支气管炎病毒(IBV)抗体
【试验原理】
临床上，传染性支气管炎是一种急性、高度传染的病毒性疾病，任何日龄的鸡都可以感染。IBV的潜伏期为24-72小时。疾病侵害鸡的呼吸系统和泌尿系统。青年鸡表现为急性呼吸道症状及气管损伤。死亡率可高达100%。血清中的病毒抗体可通过酶联免疫的方法检测。血清中的IBV抗体水平及整个鸡群的免疫状况可用ELISA方法进行监测。
将灭活的抗原包被在微孔板上，加入稀释后的血清并孵育，血清中的抗IBV抗体将与包被在微孔板上的IBV结合，形成IBV抗原-抗体复合物。然后洗掉未结合的物质，加碱性磷酸酶标记的抗鸡IgG的酶标结合物至微孔板中，酶标物将与IBV抗原-抗体复合物结合。孵育后洗掉未结合的结合物，然后加入底物溶液。底物与碱性磷酸酶反应并生成一种黄色的产物，最后终止反应，将颜色固定。颜色的深浅可用酶标仪（405-410nm）测定。
【一个微孔板所需的试剂的量】
| 抗原包被微孔板 | 12×8条（板） |
| 样品稀释液（1×） | 120ml |
| 洗涤液（1×） | 500ml |
| 阳性对照 | 2μl |
| 阴性对照 | 2μl |
| 结合物 | 12ml |
| 底物液 | 12ml |
| 终止液 | 12ml |
【所需物品】
1. 能够吸取2μl、100μl和800μl的精确移液器
2. 最大吸取100μl的多通道移液器
3. 计时器
4. 量筒
5. 蒸馏水
6. 洗板机
7. 稀释用容器
8. 能够读双波（405-410nm和630-650nm）的酶标仪，OD值读数最大可达到3.0
【样品收集】
采集至少0.5ml全血，分离血清并放在冰箱里，2-7℃用于短期储存，如果长期储存，应冷冻，且避免反复冻溶。如果样品含有可见的颗粒物质，应在检测之前将其离心除去，严重污染的样品不允许使用（如高度浑浊、细菌污染等）
【结果计算】
将阳性对照吸光度值和样品吸光度值分别减去阴性对照吸光度值，注意：对照品及样品吸光度值都应该是2个重复孔的平均值。每个样品的计算式如下：
| 样品平均吸光度值 － 阴性对照吸平均吸光度值 | ＝样品与阳性对照比值（Sp） |
| 阳性对照平均吸光度值 － 阴性对照平均吸光度值 |
Sp ×（100）＝ ELISA Unit (EU) 阳性对照值设为100 EU
【结果判定及EU单位说明】
IBV ELISA 值 说明
小于10EUs IBV抗体为阴性
10-15 EUs IBV抗体为弱阳性，应被认为经过免疫或暴露于IBV，油乳状疫苗也可能引起非特异性低水平抗体。
15-75 EUs IBV抗体适度阳性
＞75 EUs IBV抗体强阳性
【操作步骤】
1. 将试剂回温至室温，通过颠倒和涡旋将试剂混匀。
2. 将1份4×样品稀释液加入到含3份去离子水的容器中，充分混匀，例如，30ml 4×样品稀释液加入到90ml去离子水中。
3. 将1份20×洗涤液加入到含19份去离子水的容器中，充分混匀，例如，25ml 20×洗涤液加入到475ml去离子水中。
4. 稀释前将阳性对照、阴性对照和样品震荡均匀。
5. 阳性对照、阴性对照和样品均需要用样品稀释液稀释后使用。稀释比例为2μl ：800μl。将移液器调到100μl，反复吹打4次使之充分混匀。
6. 将稀释后的阴性对照、阳性对照分别加入微孔中，每种做两个平行，每孔100μl；将稀释后的样品100μl分别加入孔中，室温下静置30分钟。
7. 弃去微孔板中溶液，每孔加入300μl洗涤液洗涤，重复洗涤2次，在洗涤过程中防止酶标板变干。
8. 每孔立即加入100μl结合物，室温静置30分钟。
9. 重复步骤7进行洗板。
10. 每孔立即加入100μl底物，室温静置30分钟。
11. 不要倒掉板内液体，每孔立即加入100μl终止液。
12. 用酶标仪双波读数（405nm或410nm作为主要波长，630nm或650nm为参考波长），计算结果。
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