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磺胺七合一（SAs）检测试剂盒使用说明书
产品名称通用名称：磺胺七合一检测试剂盒英文名称：ELISA Kit to Detect SAs (7 in 1)产品编号：TH029-5 概要磺胺类药物（SAs）是应用广泛的抗菌素，对畜禽疾病控制和治疗起到重要作用。但由于磺胺类药物存在严重副作用，人体中长期存在磺胺类药物会导致许多细菌对磺胺类药物产生耐药性，且有潜在的致癌性。我国农业部第235号文件规定其残留限量为100mg/kg。包装规格96T/盒预期用途检测组织、蜂蜜、鸡蛋、血清、尿液和牛奶中存在的SAs。测定原理本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、酞酰磺噻唑、磺胺甲噻二唑与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗磺胺的抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含磺胺类药物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出残留物磺胺类药物的含量。反应时间样品处理时间：1) 组织、血清………………………………45分钟2) 蜂蜜………………………………………75分钟3) 尿样、牛奶………………………………10分钟试剂盒反应时间………………………………60分钟产品组成1、磺胺七合一酶标板：96孔2、磺胺七合一标准品：6瓶（1ml/瓶），含量分别是： 0ppb，0.4 ppb，1.2 ppb，3.6ppb，10.8ppb，32.4 ppb3、磺胺七合一标准品（添加实验）：1瓶（1ml），1ppm4、磺胺七合一抗体工作液：1瓶（10ml）5、磺胺七合一酶结合物：1瓶（7ml）6、20×浓缩洗涤液：1瓶（40ml）8、磺胺七合一2×浓缩复溶液：1瓶（50ml）9、磺胺七合一底物液A：1瓶（7ml）10、磺胺七合一底物液B：1瓶（7ml）11、终止液：1瓶（7ml），2M硫酸12、说明书一份13、盖板膜一张使用单位需自备的设备及试剂设备：┅┅微孔板酶标仪┅┅均质器┅┅振荡器┅┅刻度移液管┅┅离心机┅┅氮气吹干装置┅┅天平（感量0.01g）┅┅微量移液器：单道20μl ~200μl、100μl~1000μl                多道50μl~300μl试剂：┅┅乙酸乙酯（分析纯）┅┅磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O，分析纯）┅┅磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O，分析纯）┅┅正已烷（分析纯）┅┅氢氧化钠（分析纯）┅┅浓盐酸（分析纯）┅┅二氯甲烷（分析纯）┅┅乙腈（分析纯）┅┅去离子水溶液配制1)  1×复溶液：取50ml 2×浓缩复溶液，加去离子水50ml，混匀。用于提取后的样本复溶。密封后可在2~8℃保存三个月。2)  0.02M PB缓冲液：称取2.58g Na₂HPO₄·12H₂O，0.44g NaH₂PO₄·2H₂O，加去离子水溶解，定容至500ml。3)  乙腈-二氯甲烷混合溶液：V_乙腈：V_二氯甲烷= 1：4。4)  0.2M氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠，加去离子水溶解，定容至100ml。5)  0.5M盐酸溶液：取浓盐酸溶液4.3ml，加去离子水定容100ml，混匀。6) 1×洗涤工作液：取40ml 20×浓缩洗涤液，加去离子水760ml，混匀。密封后可在2~8℃保存三个月。待测样品前处理方法1、组织(鸡、鸭、猪肌肉／肝脏、鸡蛋、鱼、虾等)处理方法一（稀释系数1）：1) 称2.0±0.05g均质过的组织样本于50ml离心管中；2) 加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml，振荡5min，15℃ 5000g离心10min；3) 取4ml上清有机相至10ml离心管中，56 ℃氮气吹干；4) 用lml稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，加入正己烷lml，混合30s，15℃ 5000g离心5min；5) 去除上层，取下层20μl液体用于检测。处理方法二（稀释系数1）：1) 称取3.0±0.05g匀浆物置离心管中；2) 加入3ml 0.02M PB缓冲液充分振荡混匀；3) 加入4ml乙酸乙酯和2ml乙腈，充分振荡10min， 15℃，5000g离心10min；4) 移取2ml上层液体(约相当于1g的样本)在50~60℃氮气或空气下吹干；5) 加入lml正己烷溶解干燥的残留物，再加入lml稀释后的复溶液强烈振荡lmin，室温4000g离心5 min；6) 除去上层液，取20μl下层用于检测。在使用国家规定最高残留限量(100ppb)进行判定时，需进行5倍稀释(1份样本液+4份已稀释好的复溶液)。2、血清样本（稀释系数4）：1) 将血样本于室温放置30min，在10℃环境中，过滤血清或5000g离心10min，分离出血清；2) 取lml血清，加入3ml 0.02M PB缓冲液，混合30s；3) 取20μl用于检测。3、蜂蜜（稀释系数1）：1) 称取1±0.05g蜂蜜样本于50ml离心管中，加入lml 0.5M盐酸置于37℃环境中30min；2) 加入2.5ml 0.2M氢氧化钠溶液(将PH值调至5左右)，再加入4ml乙酸乙脂振荡5min，5000g室温离心10min；3) 取2ml上层液体于50℃下氮气吹干，加0.5ml稀释好的复溶液复溶，混合30s；3) 取20μl用于检测。4、尿液（稀释系数4）：1) 用3ml 0.02M PB缓冲液与lml经离心后的清亮尿样本混合，混合30s；2) 取20ul用于检测。5、牛奶（稀释系数20）：1) 取1ml牛奶样本用0.02M PB缓冲液按1：19(V／V)稀释(即20μl牛奶+380μ1 0.02M PB缓冲液)，混合30s：2) 取20μl用于检测。注意事项                               1) 使用前将试剂盒回升至室温（20-25℃）。2) 严格按说明书操作，不得改变加样顺序及温育时间，每加一种试剂前需将其摇匀。3) 尽量缩短加样时间，加入相同试剂或样品时应使用多道微量移液器。4) 洗板应保持一致性，不可更改冲洗次数。洗涤后，避免微孔干燥，否则可能会造成标准曲线不成线性或重复性不好的现象。5) 若底物液B有任何颜色表明其变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A_450nm<0.5）时，表示试剂盒可能变质。6) 若酶标板底部被污染，则在读数之前用软纸轻轻擦试微孔板底部，防止因污染而影响读数结果。7) 在所有恒温孵育过程中，要避免光线照射，应用盖板膜盖住微孔板。8) 没有用完的微孔板应存放回有干燥剂的密封袋内，2-8℃密封干燥保存，试剂盒避免冷冻。9) 不要使用过期的试剂盒及各组份，不要同时使用不同批号试剂盒中的试剂。酶免分析步骤1、将标准品和样品对应的微孔编号，每个标准品和样品做双孔平行，并记录标准品和样品的位置。2、在标准品孔中加入20µl各标准品溶液，在各样品孔中加入20µl样品溶液。3、在所有孔中加入50µl的酶结合物，再在所有孔中加入80µl的抗体工作液，轻轻晃动使之彻底混匀，用盖板膜盖住后25℃避光反应40分钟。4、小心揭开盖板膜，甩干孔中液体，用洗涤工作液（250μl /孔）充分洗涤微孔板5次，并在吸水纸上彻底拍干（拍干后未清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。5、洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50µl底物液A，再加 50µl底物液B，轻轻晃动反应板使之彻底混匀，用盖板膜盖住后置25℃避光反应20分钟(在颜色浅的情况下可适当延长反应时间，但总显色时间不要超过30分钟)。6、每孔中加入50µl终止液，轻轻晃动使之彻底混匀，在450nm（建议使用双波长450/630nm）下检测吸光度，结果在5分钟内读取。结果计算1、所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。2、以磺胺七合一浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为磺胺七合一浓度的对数值，求得反对数即为测定液中磺胺七合一浓度C（ng/ml）。样品经过稀释时应乘以相应稀释系数。样品检测下限本试剂盒的最低检测灵敏度是0.4ppb(0.4ng/ml、0.4 μg/l或0.4μg/kg)。交叉反应(特异性)磺胺嘧啶(SD或SDZ）……………………………100.0%磺胺间甲氧嘧啶/磺胺六甲氧嘧啶（SMM）…… 97.6%磺胺甲噁唑（SMZ）………………………………100%磺胺噻唑（ST）………………………………………195.0%    磺胺甲基嘧啶（SM1）…………………………… 92%酞酰磺噻唑（PST）……………………………… 73%  磺胺甲噻二唑（SMT）……...…………………… 110%样品最低检测限组织、蜂蜜、鸡蛋…………………………0.4ppb血清、尿液…………………………………1.6ppb       牛奶…………………………………………8ppb准确度（回收率）组织、蜂蜜…………………………………90%±10%       鸡蛋…………………………………………65%±10%尿样、牛奶、血清…………………………70%±10%精密度试剂盒板内变异系数小于8%，板间变异系数小于15%。贮藏条件及保存期产品保存于2-8℃，自生产日期起12个月内有效。